不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF72单克隆抗体的制备及应用

鲤疱疹病毒Ⅱ型是引起鲫造血器官坏死病的重要病原。为建立基于抗原水平的免疫检测方法,通过原核表达方法制备鲤疱疹病毒Ⅱ型核衣壳蛋白ORF72,将纯化的ORF72蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术筛选获得单克隆抗体1B3、4B1、4C2、5F4和5H9。免疫印迹分析显示,上述5株单抗均可特异性识别重组蛋白ORF72;免疫荧光分析显示,仅单抗4C2可与感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的鲫脾脏发生阳性反应。利用单抗4C2通过间接免疫荧光技术对鲤疱疹病毒Ⅱ型感染鎏金金鱼鳍条细胞系(RyuF-2)后ORF72蛋白表达情况进行检测,结果显示,感染后36 h可检测到阳性信号,并且随着感染时间的延长,细胞中ORF72的表达量明显增加。本试验制备的单克隆抗体4C2为体外进一步探究鲤疱疹病毒Ⅱ型在细胞内的复制机制及建立病鱼免疫检测手段奠定了基础。

Development and Characterization of Monoclonal Antibody Specific to Nuclear Protein of Avian Influenza Virus Type A

Five monoclonal antibodies（Mabs） to nuclear protein of avain influenza virus（AIV） were developed by syncretizing SP 2/0 and the spleen cells from BALB of mice immuized with H9 subtype AIV. Specificity of these Mabs were identified by immunofluorescent assay（IFA） and enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. These five Mabs which were named as AIV-NP-2C3, AIV-NP-6A5, AIV-NP-3 H9, AIV-NP-7B4, AIV-NP-2H4 could react with all viruses of AIV-H9 strains in tests. The result of Western blotting showed that only the 60 ku protein antigen of AIV-H9 could be recognized by the Mabs but never recognized by New castle disease virus, REV and infectious bursa disease virus. The result of preliminary application showed that avian influenza viruses could be deetected bv Mabs in IFA and ELISA. All these Mabs will probably play important roles in preventing and monitoring avian influenza viruses.

间接免疫荧光抗体技术检测凡纳滨对虾红体病病原——副溶血弧菌

建立了凡纳滨对虾红体病病原——副溶血弧菌的间接免疫荧光抗体检测方法。确定免疫血清和荧光抗体的最适工作浓度分别为1∶1000和1∶200;交叉反应和阻断试验表明该方法具有较高的特异性。用该方法检测了10份人工感染后发病的凡纳滨对虾和10份感染后外观健康的凡纳滨对虾,阳性检出率分别为100%和60%,表明该技术不仅能够检测已发病的凡纳滨对虾,而且能够检测带菌的凡纳滨对虾,这对于水产养殖业中疾病的早期诊断有着重要意义,而且该方法具有快速、特异、简单的优点,适合于现场应用推广。

鸡贫血病毒VP1基因在大肠杆菌中的高效表达及其生物学特性的初步分析

将鸡贫血病毒 (CAV)VP1蛋白 44 9个氨基酸中的 42 4个氨基酸 (占 95 % )编码序列分二段 ,分别克隆入表达性载体 pGEX - 5X - 3,在大肠杆菌以GST融合蛋白的形式获得了高效表达。以表达产物免疫小鼠 4次 ,制备了抗CAV的多克隆抗体。通过对CAV感染的MSB1细胞做间接免疫荧光试验 (IFA) ,结果为阳性。这表明表达物保留了天然VP1相关的抗原性。用此抗CAV抗体和所建立的IFA方法对临床CAV凝似病料成功地进行了实验室诊断。

非可培养状态霍乱弧菌的间接免疫荧光检测

目的建立检测水中活的非可培养状态霍乱弧菌(O1群、O139群)的间接免疫荧光法。方法用本实验室人工转化的非可培养状态霍乱弧菌的菌液制成抗原片,用混合诊断血清(抗O1群、O139群)作为一抗,异硫氰酸荧光素(FITC)标记猪抗兔IgG作为二抗,进行间接免疫荧光检测。结果该方法可以成功检测出水中非可培养状态霍乱弧菌,其检测下限约为104cells/400 ml。结论该方法具有较好的特异性和灵敏度,可作为自然水体中非可培养状态霍乱弧菌的检测方法,用于霍乱弧菌的生态研究。

间接免疫荧光法与外斐氏反应诊断恙虫病的比较

采用外斐氏反应(WF-OX_K)和间接免疫荧光法(IFA),对选取的87例恙虫病患者、53名其它立克次氏体抗体(R-Ab)携带者和60名健康人检测了恙虫病抗体,并用6项指标评价所获结果。结果IFA法明显优于WF-OX_K法,对发病1周以上的患者其敏感度为96.1％,特异度为97.3％。其它几项指标也优于WF-OX_K法。作者认为:长期以来用于恙虫病血清学诊断的WF-OX_K法不应作为诊断的唯一依据,应结合临床和流行病学综合分析。而IFA法的真实性和可靠程度已基本达到辅助临床诊断的要求,也能满足流行病学调查的需要,应予以推广。

抗伪狂犬病毒Ea株单克隆抗体的制备及鉴定

将伪狂犬病毒Ea株纯化后免疫雌性Balb/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O的骨髓瘤细胞融合,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)进行筛选,获得了2株抗PRV的单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为3G7E3和4A6F5,其细胞培养上清及小鼠腹水效价(ELISA)分别为1:212、1:212及1:100×212、1:100×212。特异性试验和免疫荧光结果显示,3G7E3和4A6F5仅与PRV反应,而与PPV、PRRSV、JEV和HCV等病毒不发生交叉反应;用单抗建立的夹心ELISA试验能检出伪狂犬病毒。表明本研究所获得的2株单抗是PRV特异性的。这2株分泌抗PRV单抗的杂交瘤细胞株的获得为进一步建立准确快速的抗原检测方法奠定了基础。

K亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备及其特异性鉴定

为了制备一种快速特异性识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的单因子血清,本试验将ALV-K接种DF1细胞,提取感染细胞DNA作为模板,PCR扩增1 005bp ALV-K-gp85和510bp ALV-K-gp85(fragment)基因。将其正确的阅读框插入表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达蛋白常规免疫昆明白小鼠制备抗血清。结果表明成功获得39.85和22.01ku的重组融合蛋白,且具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果表明两血清均可与ALV-K反应,而不与ALV-A、ALV-B和ALV-J反应。本试验首次研制获得能特异性识别ALV-K的单因子血清,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础。

猪伪狂犬病毒变异株单克隆抗体的制备与鉴定

为制备猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)变异毒株的单抗,以纯化灭活的PRV JS-2012毒株免疫BALB/c雌性小鼠。经间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)筛选,获得2株稳定分泌PRV单抗的杂交瘤细胞:4D8、4F10。2株单抗经亚型鉴定均为Ig G1亚类,轻链为κ链,腹水IFA效价均达1:51 200;IFA与IHC结果显示,二者均能与PRV毒株发生特异性反应;Western blot结果表明,4D8与PRV反应条带大小约为60 k Da,而4F10不与PRV发生反应,推测其可能针对PRV的构象性抗原表位。该单抗的制备对PRV的抗原变异及诊断研究均有重要意义。

H9N2亚型禽流感病毒HA基因的表达及其单因子血清的制备

为了制备特异性识别H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的单因子血清,本试验提取H9N2亚型AIV RNA,RT-PCR后,分别扩增上段HA1、中段HA2和下段HA3 3段基因。将他们插入原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(Rosetta)菌株中表达。将表达的蛋白常规免疫昆明白小鼠,以制备抗血清。结果显示,成功获得3段重组融合蛋白,且均具有良好的免疫原性。间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,上段HA1、中段HA2制备的单因子血清均可与H9N2亚型AIV反应,而下段HA3则不能。重组马立克氏病病毒(MDV)MZC12 HA/NA同样证明HA1、HA2两段制备的单因子血清能识别HA基因的表达。本试验成功制备了识别H9N2亚型AIV HA的单因子血清,为H9N2亚型AIV的鉴别诊断及研究奠定了基础。

牛病毒性腹泻病毒p80蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

为了制备牛病毒性腹泻病毒（BVDV）p80蛋白单克隆抗体,试验采用BVDV接种牛肾细胞（MDBK）,提取病毒RNA,通过RT-PCR扩增出BVDV的p80基因,将其定向克隆到原核表达载体pET30a,得到重组表达质粒pET30a-p80。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌,挑选单菌落并扩大培养,经IPTG诱导和SDS-PAGE以及Western-blot分析表明重组蛋白p80获得了表达,分子质量约为44ku。同时用浓缩的BVDV培养液免疫6-8周龄的Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合。利用纯化的重组蛋白p80作为检测抗原的间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆后对获得的杂交瘤细胞进行间接免疫荧光（IFA）和抗体亚类鉴定及腹水的制备和效价的测定。结果表明：重组p80蛋白具有很好的反应性;获得8株稳定分泌针对BVDVp80蛋白的杂交瘤细胞株,分别为3E3、2A4、8H9、3G3、2B3、3G2、2G2和4A11;8株杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠制备腹水,采用BVDV作为包被原的间接ELISA方法测得其效价为1×10^5-1×10^7;8株杂交瘤细胞所分泌的MAb具有良好的反应性和特异性;8株单克隆抗体的抗体亚类均为IgM/κ。说明制备的重组p80蛋白单克隆抗体可试用于建立检测BVDV抗原的诊断方法。

禽流感病毒血凝素基因突变体的构建及其在293T细胞中的表达

采用PCR定点突变技术,通过重叠延伸法3次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pcDNA3载体中,DNA测序表明在预期位点已经发生突变,HA基因裂解位点的氨基酸组成为RKKR↓GLF突变为RSSR↓GLF,通过磷酸钙共沉淀方法将HA基因突变体的重组质粒瞬时转染293T细胞,采用间接免疫荧光鉴定其表达情况。IFA证实突变后的HA在细胞膜上获得了有效表达。HA基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位点导致AIV进入细胞的发病机制和HA蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。

整合进禽反转录病毒长末端重复序列的马立克氏病病毒的分离鉴定

应用鸭胚成纤维细胞(DEF)从曾免疫过CVI988/Rispens株疫苗的患马立克氏病(MD)肿瘤的三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒(MDV,命名为GXY2株。用禽肿瘤病聚合酶链式反应(PCR)鉴别诊断技术对患鸡的肿瘤组织病料及克隆纯化毒株的DEF培养物进行检测,结果均扩增到MDV-1强毒株的132-bpr特异性带和网状内皮组织增殖病病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)。用基于抗MDV-1的gB蛋白单克隆抗体BA4、MEQ蛋白单克隆抗体3G12E6和抗REV的单克隆抗体11B118分别对毒株的培养物进行间接免疫荧光试验(IFA),结果样品只与抗MDV-1的单克隆抗体呈现阳性反应,而与抗REV的单克隆抗体呈现阴性反应。应用PCR技术扩增并测定了毒株的致瘤相关基因meq的核苷酸序列,并与其他MDV-1参考毒株的序列进行比较分析,结果发现其序列与我们之前分离鉴定的MDV-1野强毒株G2和YL040920高度同源。研究的结果表明,分离株GXY2为整合有REVLTR片段的重组MDV强毒株。

猪瘟病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为了建立猪瘟病毒(CSFV)检测的间接免疫荧光(IFA)法,试验以猪瘟阳性血清为一抗、荧光素FITC标记的羊抗猪IgG为二抗,将CSFV接种于猪血管内皮细胞(EC)后,并对反应条件进行优化。结果表明:IFA法最佳工作条件为猪瘟阳性血清1∶200倍稀释,荧光素FITC标记的羊抗猪IgG荧光抗体1∶50倍稀释;用建立的IFA法检测CSFV感染的EC为阳性,而用猪圆环病毒(PCV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的EC检测结果为阴性。说明建立的检测细胞培养中CSFV抗原的IFA法具有敏感性、特异性、简便快速等优点,可用于CSFV在EC上的感染和定位研究。

清开灵注射液体外抗2型登革病毒的作用

目的研究清开灵注射液(简称清开灵)体外抗2型登革病毒(dengue virus 2,DENV2)的作用。方法 (1)稀释清开灵至不同质量浓度(72.000、63.000、54.000、45.000、22.500、11.250 mg/mL),同时稀释利巴韦林注射液(简称利巴韦林,12.500、6.250、3.125、1.563、0.781、0.391 mg/m L)作为阳性对照,生理盐水为空白对照,利用MTT比色法分别检测上述药物对人肝癌细胞HepG2株的细胞毒性作用,并确定各药物的最大无毒质量浓度;(2)分别稀释清开灵和利巴韦林并与DENV2(MOI=0.5)等体积混合孵育30 min后,接种于HepG2细胞,于2、8、24 h后取细胞上清,利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测阳性细胞率和实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测DENV2基因组表达水平,验证清开灵对DENV2的直接灭活作用;(3)稀释清开灵或利巴韦林并与DENV2(MOI=0.5)等体积混合后接种于HepG2细胞,2 h后收获细胞,利用IFA验证清开灵对DENV2的抑制作用;(4)DENV2(MOI=0.5)感染HepG2细胞1 h后,弃上清加入含清开灵或利巴韦林的维持液,于感染后2、8、24 h收获细胞上清,利用IFA和qPCR验证清开灵直接给药的抗病毒作用;(5)用清开灵或利巴韦林预处理HepG2细胞2 h,加入DENV2(MOI=0.5)孵育1 h弃上清,再次相应加入清开灵和利巴韦林(维持治疗),于感染后2、8、24 h收获细胞上清,IFA和qPCR验证清开灵预给药联合维持治疗的抗病毒作用。结果 (1)清开灵的最大无毒质量浓度为11.250 mg/m L,利巴韦林的最大无毒质量浓度为1.563 mg/m L;(2)直接灭活:2、8、24 h,清开灵和利巴韦林检测水平均优于空白对照(P<0.01),而且清开灵在2 h和24 h的IFA检测水平均优于利巴韦林(P<0.01),以及8 h和24 h的qPCR检测水平均优于利巴韦林(P<0.01);(3)抑制病毒进入:清开灵与利巴韦林的IFA检测均优于空白对照(P<0.01);(4)直接给药:药物作用2、8、24 h后,清开灵和利巴韦林不同时相点检测水平均优于空白对照(P<0.01);(5)预给药联合维持治疗:药物作用2、8、24 h后,清开灵和利巴韦林不同时相点检测水平均优于空白对照(P<0.01),而且清开灵的不同时相点的IFA检测水平均优于利巴韦林(P<0.01)。结论清开灵具有明显的体外抗DENV2的作用,且以预给药联合维持治疗的给药方式抗病毒作用最佳。

广州地区2018年儿童常见呼吸道感染病原学分析

目的了解广州市儿童呼吸道感染8种呼吸道病原体的流行病学特征,为临床提供诊疗参考。方法选择2018年1月至12月共9179例在本院诊断为呼吸道感染的患儿,采用间接免疫荧光法(IFA)来检测引起人呼吸道感染的8种常见呼吸道病原体的IgM抗体,包括:嗜肺军团菌(LP1)、肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IV-A)、乙型流感病毒(IV-B)、副流感病毒(PIV),并收集患者的临床资料,对所有数据进行统计学分析。结果9179例标本中,检出阳性标本4437例,总阳性率为48.34%,其中IV-B阳性率最高(40.16%),其次是IV-A(30.69%)、MP(27.97%),其他病原体呈散发。在各年龄组中,幼儿组总体阳性率明显高于其他年龄组。春夏季的病毒病原体IgM抗体检出率高于秋冬季。结论2018年广州地区儿童呼吸道感染病原体以IV-A、IV-B为主;夏季呼吸道病毒病原体IgM抗体阳性检出率最高,幼儿为呼吸道感染的高发人群。

评价3种免疫学检测方法在儿童腺病毒感染诊断中的应用价值

目的2评价直接免疫荧光法、间接免疫荧光法与酶联免疫吸附法3种检测方法对儿童腺病毒感染诊断的应用价值。方法回顾性分析2019年1月至2021年1月间我院检验科接收的221例同时进行上述3种检测的病例,计算每种方法的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值等,对3种检测方法进行配对χ^(2)检验,同时按年龄分组进行统计学分析。结果直接免疫荧光法灵敏度为58.49%、特异性为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.42%、Kappa值为0.682,间接免疫荧光法灵敏度为84.91%、特异性为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为95.45%、Kappa值为0.895,酶联免疫吸附法灵敏度为92.45%、特异性为80.36%、阳性预测值为59.76%、阴性预测值为97.12%、Kappa值为0.613,3种方法两两间比较差异均有统计学意义。按照年龄分组显示每组间接免疫荧光法的统计学指标具有优势。结论间接免疫荧光法特异性和阳性预测值较好,检测结果与临床诊断一致性较好,对于儿童腺病毒感染具有较好的应用价值。

抗丝状支原体丝状亚种单克隆抗体的制备及初步应用

旨在制备抗丝状支原体丝状亚种(Mmm)的特异性单克隆抗体(MAb),为牛传染性胸膜肺炎(CBPP)病原诊断的免疫学方法提供特异性抗体。本研究利用生物信息学技术分析了Mmm国内分离株Ben-1不同传代株的全基因组序列,选取M0071蛋白作为研究对象。将原核表达的可溶性重组蛋白M0071(rM0071)作为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过有限稀释法和间接ELISA方法筛选得到能稳定分泌抗rM0071蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。进一步制备单抗腹水并纯化,利用Western blot方法对该单抗进行特异性鉴定,同时测定其抗体效价和抗体亚类。随后利用间接免疫荧光试验(IFA)评价该单抗对细胞感染Mmm的检测能力。结果表明成功获得1株单克隆细胞株3C4A1,将其分泌抗体命名为MAb 3C4A1。特异性结果表明,MAb 3C4A1能与Mmm的分离株和标准株发生特异性反应,而不与山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、牛鼻支原体、无乳支原体、牛支原体、leachii支原体和牛A型巴氏杆菌等发生反应。抗体亚类鉴定MAb 3C4A1属于IgG1亚类、轻链为κ链。经间接ELISA测定其抗体效价为1∶256000。IFA试验结果表明,MAb 3C4A1仅与感染EBL细胞的Mmm发生绿色荧光反应,而与牛鼻支原体、无乳支原体、牛支原体感染的细胞不发生荧光反应,特异性良好。本研究制备的MAb 3C4A1具有良好的特异性和免疫反应性,可作为CBPP病原免疫学诊断的工具,为进一步研制CBPP病原鉴别诊断试剂盒提供了基础材料。

家蚕微孢子虫NbTom40的原核表达及定位

线粒体外膜易位酶是由Tom40基因编码的位于线粒体外膜上的转位酶复合体,能够将外界蛋白质转位运输到线粒体基质中.最近有研究称在一类仅具有简缩进化的线粒体——纺锤剩体的感染家蚕微孢子虫的基因组鉴定到一个NbTom40基因.本文首先通过克隆了长度为839bp的NbTom40基因,通过构建重组载体pET30a(+)-NbTom40,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,经过HIS抗体的免疫印迹对表达的目的蛋白——31～43kDa间存在一条单一条带进行验证,结果显示该条带即为分子量大小正确的带有HIS标签的目的蛋白,然后将其进行Ni-NTA亲和层析以及聚丙烯酰胺凝胶纯化并制备多克隆抗体.NbTom40抗体与家蚕微孢子虫总蛋白的Western Blotting结果显示,在32kD处有明显杂交信号,与理论分子大小一致.最后,通过间接免疫荧光(IFA)对该基因编码的蛋白进行细胞定位,观察到NbTom40以散点状荧光信号分布在孢子内部.本研究为深入了解纺锤剩体的蛋白组成及其膜转运的分子机制奠定了分子生物学基础.