Isolation and Identification of Avian Infectious Bronchitis Virus

[ Objective] The aim was to isolate and identify avian infectious bronchitis virus （IBV） from diseased chickens. [ Method] IBVs were iso- lated from the diseased chickens in a chicken farm in Anhui Province with blind passage method to observe virus pathogenicity. Then animal regres- sion test was made to replicate symptoms of bronchial congestion in SPF chickens and S1 gene segments were amplified and isolated, followed by comparison with IBV vaccine strains. [ Result] Detection of Hemagglutinating activity （HA） showed that allantoic fluid had no concerning effect on erythrocyte, suggesting that NDV and AIV were not included in the isolated viruses. However, the erythrocyte could be agglutinated with allantoic fluid treated with 1% of pancreatin, which is in consistent with biological characters of IBV. After SPF chickens were inoculated with the 6^th SPF al- lantoic fluid, bronchial congestion was replicated, proving that the isolated virus was avian IBV, named IBV XZ strain. [ Conclusion] This study pro- vides a theoretical basis for prevention of avian infectious bronchitis.

2株重组禽传染性支气管炎病毒的分离鉴定及基因组序列分析

【目的】了解禽传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的遗传变异情况。【方法】采集山东地区部分养殖场中疑似IBV感染鸡病料组织,接种SPF鸡胚进行病毒分离鉴定,利用二代测序技术进行全基因组测序鉴定,并基于全基因组序列进行遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】感染鸡剖检可见气管环出血,管腔内有黄色或黑黄色栓塞物等。从病料中共分离获得2株IBV,分别命名为SDJN和SDLY。相似性分析结果显示,分离株SDJN和SDLY与GⅠ-19基因型参考毒株相似性较高,核苷酸序列相似性为96.0%~97.3%,氨基酸序列相似性为94.9%~100%。氨基酸序列分析结果显示,2株IBV分离株与其他毒株相比存在多个氨基酸变异位点。系统进化树结果显示,分离株SDJN和SDLY与IBV GⅠ-19基因型参考毒株位于同一分支。重组分析结果显示,分离株SDJN和SDLY为多种基因型毒株的重组毒株,均以ck/CH/LDL/091022株为主要亲本毒株。【结论】本研究从山东地区分离得到2株IBV,2株分离株与GⅠ-19基因型毒株密切相关,是一种新型重组IBV毒株。研究结果为进一步研究IBV流行与进化及禽传染性支气管炎的防控奠定基础。

鸡传染性支气管炎诊断方法的研究进展

鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒引起的一种呼吸道传染病。传染性支气管炎病毒传染性较强,给养鸡业的健康发展带来严重威胁。该病毒具有较多的血清型,且经常出现变异,因此需要做好鸡传染性支气管炎的诊断工作,能最大程度控制本病的传播。本文综述了病毒分离鉴定、血清学诊断和分子生物学诊断等几种常用的鸡传染性支气管炎诊断方法,以期为生产中该病的准确诊断提供参考。

鸡传染性支气管炎病毒肾致病株的分离和鉴定

从广西13个鸡场,有呼吸道症状及尿石症的病鸡中分离出 C、G、Z、Q4株病毒。病毒经电镜观察,其大小在94～108nm 之间,囊膜外有特征性疏松排列的刺突。敏感鸡接种16～36小时后出现呼吸道症状,剖检病鸡时大多数鸡肾肿大并有尿酸盐沉积。各毒株接种鸡胚都能产生体儒胚;被56℃1小时灭活;在鸡胚中均能干扰鸡新城疫病毒 LaSota 株的生长。C_(19)株可被鸡传染性支气管炎病毒标准阳性血清所中和。G_3不被 IUDR 所抑制,属 RNA 病毒;对乙醚敏感,证明属有囊膜病毒。从以上各项鉴定指标证明,所分离的4株病毒是引起鸡尿石症的传染性支气管炎病毒。据作者的经验,提出分离鸡传染性支气管炎病毒较为合理的模式。

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离及鉴定

从浙江省内大型商品代鸡场和专业户鸡场出现的以肾肿大为主要特征的呼吸道疾病病鸡中分离到六株病毒，易感雏鸡．接种３ｄ后出现一过性呼吸道症状，感染鸡死亡集中在感染后１４～１８ｄ，病死鸡出现肾肿大、苍白呈花斑状、大量尿酸盐沉积．鸡胚感染后出现死亡和产生侏儒胚，鸡胚尿囊液不凝集红细胞，电镜观察可见约１２０ｎｍ的病毒粒子．分离病原在鸡胚中可干扰新城疫病毒Ｌａｓｏｔａ株的繁殖．上述试验证实分离毒株为鸡肾型传染性支气管炎病毒．

两株鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S1基因序列分析

为调查广东地区鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的流行及其遗传变异情况,本研究通过病料SPF鸡胚接种和鸡胚尿囊液的RT-PCR鉴定,于2013年从广东湛江地区不同发病鸡场分离到两株IBV,分别命名为CK/CH/GD/ZJ10/2013和CK/CH/GD/ZJ11/2013,并对这两株IBV的S1基因进行序列分析。结果显示,CK/CH/GD/ZJ10/2013株S1基因全长1 626bp,编码542个氨基酸,其裂解位点为NRFRR,属于基因型Ⅲ,并推测其为基因型Ⅲ毒株（CK/CH/GX/NN11-3）与基因型Ⅰ毒株（GX-NN-6）在S1基因处发生重组而产生的新毒株;CK/CH/GD/ZJ11/2013株S1基因全长1 620bp,编码540个氨基酸,其裂解位点为HRRRR,属于基因型Ⅰ（类QX型）;两株IBV的S1基因间核苷酸序列及其推导的氨基酸序列同源性较低,与位于同一基因型的参考毒株间同源性较高,而与中国使用的Mass型常规疫苗H120和H52之间的同源性最低,仅为75.7%~76.3%和77.1%~77.9%。本研究可为广东省IBV的流行病学调查和分子生物学研究提供参考。

鸡传染性支气管炎病毒CQ/01/2004株的分离与鉴定

2004年从重庆某肉用鸡场疑似鸡传染性支气管炎的病鸡中采集病料,按常规处理后接种9～10日龄鸡胚,通过鸡胚连续传代培养3代,并对该分离毒株的鸡胚致病性、血凝性和NDV的干扰特性进行检测,同时进行了动物回归试验。结果表明,该分离株具有IBV感染特征,可使鸡胚胚体出血、蜷缩、矮化;该分离毒株无直接血凝性,对NDV有明显的干扰作用;动物回归试验中有75%的感染鸡在10d内发病或死亡。剖检病死鸡可见肾苍白、肿胀,肾小管内充塞大量尿酸盐,支气管有出血点、有大量粘液。采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对CQ/01/2004的纤突蛋白S1基因进行扩增、克隆和序列测定,结果表明该基因具有IBVS1基因的共有分子特征,将测序结果提交GenBank进行同源性检索,发现分离株CQ/01/2004和J株S1的同源性最高,核苷酸同源性为94%,氨基酸同源性为89.4%,与M41的核苷酸同源性为80.6%,氨基酸同源性为78.0%。试验结果表明,分离的病毒株CQ/01/2004为鸡传染性支气管炎病毒。

鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定

[目的]为研究传染性支气管炎(IBV)的流行变异及其防治奠定基础。[方法]从辉县某大型养鸡场疑似IBV的发病鸡群中采集病料,进行病毒分离和鉴定,并对分离病毒的M基因进行RT!PCR扩增。[结果]从鸡病料中分离到1株IBV,命名为IBV!HN05。经浓度1%胰酶、卵磷脂酶C和10%乙醚处理后,该病毒尿囊液可以凝集鸡、绵羊、人、小鼠和兔的红细胞,而未处理的病毒尿囊液则无此凝集活性。该分离株IBV-HN05和标准毒株IBVM41对NDVLaSota都有抑制作用。该病毒对9日龄鸡胚的致病变率达100%。通过鸡胚矮小试验和动物回归试验,发现该分离株能引起鸡胚和病鸡典型的临床症状和病理变化。PCR扩增结果进一步证实了该分离株为IBV病毒。[结论]该研究为SARS病毒的研究提供了动物模型。

鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LHLJ/04V的分离鉴定及致弱的初步研究

从黑龙江省某鸡场发病鸡群的肾脏中分离到一株病毒,通过病毒致SPF鸡胚病变特征、对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征以及RT-PCR鉴定等方面的研究,表明该病毒为鸡传染性支气管炎病毒,并命名为CK/CH/LHLJ/04V。通过对该病毒基因型分析以及对SPF鸡致病性试验发现该病毒为我国近年来流行的一类重要IBV的代表。将该毒株在SPF鸡胚连续传代110代(P110),取不同代次毒进行动物实验。结果显示,该毒株对SPF雏鸡的致病力随鸡胚传代次数的增加而逐渐降低。P110代毒以105.0 EID50/0.1 mL的剂量通过点眼滴鼻接种15日龄SPF雏鸡,鸡群发病率和死亡率均为0。不同代次毒接种SPF鸡对同源毒株P3代强毒的攻击均具有100%保护性。实验表明,IBV毒株CK/CH/LHLJ/04V P110对SPF雏鸡已无致病性,但仍具有良好的免疫原性,可作为研制IB弱毒疫苗的候选毒株。

免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒的分离和鉴定

[目的]鉴定免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒（IBV）。[方法]以接种IBV的鸡胚尿囊液为模板，根据GenBank中登录的IBV的N基因序列设计引物，通过RT-PCR扩增出目的片段，经酶切鉴定后对其进行测序鉴定。[结果]PCR扩增片段长度为409bp，将其Ⅳ基因核苷酸序列与不同地区分离株（山东、黑龙江等）以及欧洲呼吸型疫苗株（M41）的IBV核苷酸序列进行比较，结果表明，不同毒株的核苷酸同源性在85．6％～100．0％，此次分离所得IBV的N基因与IBVSD0708株（EU352625）N基因的核苷酸同源性高达99．3％，而与呼吸型疫苗株M41（M28566）的同源性仅为87．3％。测序结果及序列分析可以证实分离到的病毒为IBV，命名为HN／HL株。[结论]该研究为鸡传染性支气管炎病毒的控制奠定了基础。

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

通过鸡胚接种盲传,从重庆某地疑似鸡肾型传染性支气管炎的发病鸡群中,分离到一株病毒,该病毒能导致鸡胚出现侏儒胚。用此病毒回归10日龄雏鸡,可使试验鸡出现典型的花斑肾。尿囊液毒穴36～48h雪经差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心纯化,在电镜下能观察到典型的冠状病毒形态,病毒粒子直径为80～120nm,有囊膜、纤突。应用反转录-聚合酶链式反应穴RT-PCR雪技术扩增出了该病毒的特异性基因M和N,这从分子水平进一步证实引起鸡群死亡的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。

鸡传染性支气管炎病毒豫北株的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定鸡传染性支气管炎病毒。[方法]从豫北某蛋鸡场疑似鸡传染性支气管炎的病鸡中采集气管分泌物、肾脏等组织分离病毒,进行血凝试验、NDV干扰试验,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对HN07的纤突蛋白S1基因进行扩增、克隆和序列测定。[结果]结果表明,分离到1株病毒,经连续鸡胚传代后,出现侏儒胚和蜷缩胚;血凝试验中,尿囊液无血凝性,而经胰酶处理后有血凝性;NDV干扰试验中,分离的尿囊液明显干扰NDV的增殖;病毒回归试验中病毒可引发接种鸡37.5%死亡;RT-PCR检测试验中,扩增到了约为1.7 kb的目的片段。DNAstar软件分析表明,测定基因具有IBVS1基因的共有分子特征,而且分离株HN07和HD株S1的同源性最高,核苷酸同源性为93.6%。[结论]分离的病毒株HN07为鸡传染性支气管炎病毒。

5株传染性支气管炎病毒分离株的鉴定和血清分型

从四川、重庆和广东3个不同地区,不同时间发病的肉鸡中分离出5株病毒.通过鸡胚发育试验、NDV干扰试验、动物回归试验和感染后鸡血清中抗体水平变化确定这5株病毒均为传染性支气管炎病毒.血清中和试验表明,这5株病毒血清型与北京分离的A2株一致,而与H52、H120、M41、T和Holte株不同.该研究结果证实了鸡传染性支气管炎病毒类4/91毒株在我国华南和西南地区的流行.

鸡传染性支气管炎病毒M41株种毒的冻干鉴定

为制备合格的鸡传染性支气管炎病毒M41株种毒,将M41株毒种接种SPF鸡胚进行传代培养,收获尿囊液、分装、冻干,并对冻干毒进行了无菌检验、支原体检验、剩余水分测定、真空度测定、外源病毒检验、病毒含量测定、特异性检验、致病性试验。结果表明,该冻干毒种各项检验均符合规定,可作为研究用种毒。本研究可为其他禽源病毒种毒的制备提供借鉴。

鸡传染性支气管炎病毒Jin13株的分离与鉴定

为了对近年从郑州郊区鸡群中分离到的1株传染性支气管炎病毒(Jin13株)进行定型鉴定,作者采用气管环(TOC)中和试验、血凝抑制(HI)试验、单抗交叉ELISA、序列分析和免疫试验对其进行了研究。气管环(TOC)中和试验和血凝抑制(HI)试验表明Jin13病毒只与M41阳性血清反应,而与其它ND、EDS76、H9AI、IBD标准阳性血清不发生反应,序列分析证实该分离毒Jin13株是IBV。在交叉气管环(TOC)中和试验和交叉血凝抑制(HI)试验中Jin13株与肾变型Y株不交叉(R≤0.25),而与马萨株血清型的M41株和H52株有明显交叉(0.25≤R≤0.8);单抗交叉ELISA结果显示Jin13株与针对M41株的J1单抗有很好的反应(≥640～1 280),而与针对肾变型Y株的单抗C2几乎不反应(≤40),这进一步证实了Jin13与呼吸型M41株、H52株属同一血清型。与M41株相比较,Jin13株S1氨基酸序列在第126,386,390,461位出现了突变,又在S1基因第1 166位出现一个新Aiu I酶切位点,是M41株的一个变异株。对Jin13株纯化后原代毒进行免疫效力检测证实其免疫原性优于M41株和H52株。Jin13毒株是一株免疫原性良好的IBV地方流行毒株。

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定与防治

【目的】对新疆疑似肾型传染性支气管炎发病鸡病料进行病毒分离和鉴定。【方法】采用3种不同的治疗方案对发病鸡群进行治疗。【结果】经过处理的病料组织在SPF鸡胚上盲传至第3～4代后，鸡胚出现尿囊绒毛膜增厚，鸡胚卷缩变小、侏儒胚等鸡传染性支气管炎的特征性病变。将收获的病毒液进行电镜观察、病毒中和试验、病毒干扰试验、动物回归试验等证实，分离的3株病毒均属于鸡肾型传染性支气管炎病毒。【结论】电解多维＋肾肿散（中药）＋阿莫西林组合的治疗效果最好，治愈率达到80％～90％。

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从陕西省榆林市某蛋用种鸡场疑似肾型传染性支气管炎病鸡中分离到了1 株肾型IBV(定名为YL 04),并对分离病毒进行了血凝性、血凝抑制性、致病性、鸡胚矮小化、电镜特征等生物学特性鉴定及S1基因5′端的RT PCR鉴定。结果表明,该分离株经10 g/L胰酶处理后的各代病毒尿囊收集液均可凝集鸡红细胞;标准阳性血清可特异性地抑制其凝集性;可复制出与自然发病相同的病例;病毒传代物有明显的致鸡胚矮小化作用;透射电镜下可见有近似球形、直径100 nm左右的冠状病毒粒子;用RT PCR方法扩增到1 条373 bp的目的片段,其核苷酸序列与IBV CQ/01/2004株序列的同源性达98%。

腺胃型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从河北病鸡肿大腺胃中分离到1株病毒(命名为CK/CH/HBHS/07F株),经鸡胚传代、血凝特性测定、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)干扰试验、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)膜蛋白(membrane protein,M)基因序列分析、人工感染试验等方法对该病毒进行了鉴定。该分离毒株感染鸡胚的尿囊液没有直接血凝活性,经胰酶处理后可凝集鸡红细胞,其血凝活性可被IBV阳性血清所抑制;经鸡胚传至第3代时,可致死鸡胚或出现侏儒胚;序列分析结果表明,该病毒M基因与18株不同致病型IBV毒株间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82.8%~94.1%、82.4%~97.4%,与腺胃型毒株CK/CH/LJL/04I同源性最高,该分离株能人工复制出与自然病例相似的病理变化。初步证实CK/CH/HBHS/07F株为腺胃型IBV。

鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LDL05Ⅱ的分离鉴定及生物学特性

采取2005年大连某鸡场发病鸡群萎缩的输卵管进行处理,经鸡胚尿囊腔接种SPF鸡胚,分离到1株病毒。通过致SPF鸡胚病变特征、病毒对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征、对SPF鸡致病性及死亡率等方面的研究,发现病毒经鸡胚传毒至第3代可致鸡胚生长发育障碍(侏儒胚)、胚体严重卷曲且大腿及尾部有点状出血;病毒囊液不凝集鸡的外周血红细胞;在电镜下呈球形,病毒囊膜表面有疏松排列的棒状纤突,具有冠状病毒粒子的形态特征;以105.5×EID50/0.1mL的病毒接种15日龄的SPF雏鸡,鸡群发病率为22/22(100%),死亡率为12/22(54.5%)。根据以上结果确定该病毒为冠状病毒,命名为CK/CH/LDL05Ⅱ。在此基础上,用RT-PCR对CK/CH/LDL05Ⅱ的核蛋白基因进行了克隆、测序和分析。与GenBank中26株IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较分析,发现该毒株与我国2004年分离IBV毒株CK/CH/LDL/04Ⅱ的N基因推导氨基酸同源性最高(97.5%),表明两者具有较近的亲缘关系。这一结果不但从分子水平证实毒株CK/CH/LDL05Ⅱ是鸡传染性支气管炎病毒,而且表明该血清型的毒株最近连续2年存在于大连市的不同鸡场。