健康安格斯犊牛与IBRV感染犊牛鼻腔菌群变化比较

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)是一种对全球养牛业造成严重影响的牛呼吸系统病毒。对新疆南疆地区4个规模化安格斯肉牛繁育场1月龄安格斯犊牛进行IBRV感染流行病学调查,探讨IBRV感染犊牛的鼻腔菌群变化。临床调查出现呼吸道疾病症状(主要包括发热、咳嗽、呼吸困难)的1月龄安格斯犊牛,采集犊牛鼻拭子,进行IBRV PCR检测,依据PCR检测结果,随机选取单纯IBRV阳性犊牛(P组)和IBRV阴性且无其他呼吸道病毒感染的健康犊牛(N组)各10头,采用16S rRNA基因测序技术,选择V3和V4可变区使用Illumina平台对鼻腔菌群DNA片段进行双端(Paired-end)测序,分析两组犊牛鼻腔菌群组成结构和功能预测。结果显示,该牛场犊牛出现呼吸道疾病症状共计922头,犊牛呼吸道疾病临床症状发生率为8.2%(922/11 215);其中死亡98头,病死率为10.6%(98/922)。样品IBRV检出率为22.0%(50/227)。与N组犊牛鼻腔菌群分类单元数相比,P组犊牛在门、纲、目、科水平上呈极显著增加(P<0.01),且属水平也呈增加趋势(P=0.056)。Alpha多样性显示,P组犊牛鼻腔菌群均匀度(Pielou_e)和覆盖度(Goods_coverage)指数显著高于N组犊牛(P<0.05),Beta多样性中P组犊牛鼻腔菌群结构与N组犊牛有显著差异(P<0.05)。菌门和菌属差异性显示,P组犊牛的厚壁菌门(Firmicutes)丰度极显著低于N组犊牛(P<0.01),绿弯菌门、酸杆菌门(Acidobacteria)、蓝菌门(Cyanobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)丰度极显著高于N组犊牛(P<0.01);P组犊牛的动性球菌属(Planococcus)、盐水球菌属(Salinicoccus)丰度显著低于N组犊牛(P<0.05),嗜盐单胞菌属(Halomonas)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)丰度显著高于N组犊牛(P<0.05)。P组犊牛在MetaCyc代谢通路中存在9条代谢通路变化,在KEGG代谢通路丰度预测中存在7条代谢通路变化,主要和参与合成,炎性反应标志物和影响机体生长发育相关。此外,两组间鼻腔菌群在细胞功能、物质运输、分解和合成代谢以及疾病发生等预测功能方面也存在差异。本研究初步揭示了呼吸道症状病牛群中IBRV感染和鼻腔菌群组成结构及功能变化密切相关,为进一步探明犊牛感染IBRV后的发病机制提供了理论参考。

IBRV内蒙古分离株gD基因的分子克隆与序列分析

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒(GenBank NC_001847)gD基因序列设计1对特异性引物,采用PCR方法扩增出内蒙古分离株gD基因的cDNA,重组到PMD19-T载体中,并进行克隆及序列测定。经限制性内切酶谱分析和序列分析,证明所克隆的cDNA为gD基因。该基因片段长1 559bp,包含1个由1 251bp组成的完整开放阅读框(ORF),共编码417个氨基酸。序列比较和系统进化树分析结果显示:内蒙古分离株gD基因与GenBank上已发表的其它分离株相比,核苷酸同源性在99.1%～99.9%之间,其推导的氨基酸同源性在90..6%～99.8%之间,在系统进化树中内蒙分离株与AJ004801株亲缘关系较近,属于同1个分支。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白具有亲水性,有很强的抗原性,有3个潜在糖基化位点,可能存在2个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。

牛传染性鼻气管炎IBRV/JZ06-3基础毒株毒力返强试验

对IBRV/JZ06-3基础毒株免疫犊牛后是否会出现毒力返强现象进行了研究。以4m L/头病毒含量为107.4TCID50/m L的IBRV/JZ06-3弱毒活疫苗滴鼻免疫犊牛,通过疫苗回滴毒力测定、连续临床观察、采集鼻拭子分离病毒进行分析结果表明,IBRV/JZ06-3基础毒株免疫犊牛后没有出现传染性鼻气管炎病毒感染的临床症状,从鼻拭子中未分离出病毒,可见该毒株对犊牛免疫后没有出现毒力返强现象。

IBRV感染对牛单核巨噬细胞产生一氧化氮(NO)的影响

为探讨牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)感染牛单核巨噬细胞后的免疫机理,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离牛外周血单个核细胞,再经贴壁培养获得单核巨噬细胞。应用Griess法检测接种IBRV后6、12、24、48h时间段的牛单核巨噬细胞分泌一氧化氮(NO)的含量,结果显示,单核巨噬细胞感染IBRV后产生NO的量均高于对照组(P<0.05),攻毒24h时巨噬细胞产生NO的量达到最高水平(607.87μmol/L)。结果表明,IBRV感染可以对单核巨噬细胞分泌NO的量产生影响,这可能和IBRV引起的致病机理有一定关系。

IBRV在MDBK细胞中的增殖规律研究

为了探讨牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）在MDBK细胞上的增殖规律,试验用100TCID50剂量的IBRV接种MDBK细胞,在不同时间点用倒置显微镜观察细胞病变效应（CPE）,同时用TaqMan荧光定量PCR技术对病毒DNA含量进行检测,绘制病毒增殖曲线。结果表明：病毒6-12h增殖缓慢,24-72h增殖快,72-144h增殖不明显;48小时时细胞出现病变,120小时时单层细胞基本脱落。说明IBRV可以在MDBK细胞中增殖并引起细胞病变,而且CPE情况与病毒的增殖规律相吻合。

IBRV内蒙古分离株NM06 gE基因的克隆与序列分析

参考GenBank发表的牛疱疹病毒Ⅰ型全基因序列设计gE基因PCR扩增引物,以牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株NM06提取的DNA为模板,运用PCR的方法扩增gE基因,扩增产物经克隆、序列测定和拼接,结果表明:测定序列全长为2086bp,包含gE基因1793bp,其中有1728bp组成的完整开放阅读框,编码576个氨基酸。将NM06株gE基因序列与GenBank发表的参考毒株核苷酸序列相比,与4株BHV-1病毒的同源性在99.3%～99.9%;与2株BHV-1.1型分离株同源性高达99.5%、99.6%;与BHV-1.2型分离株同源性为93.4%。从进化树中也可以看出:NM06株与BHV-1.1型分离株属于同一个进化分支,而BHV-1.2BH83株属于另一个进化分支,可以推测IBRVNM06分离株属于BHV-1.1型。NM06株与牛疱疹病毒5型N569病毒的同源性为82.9%,与鹿疱疹病毒2型Norway4病毒的同源性为72.6%。

青海省海北州牦牛血清BVDV、IBRV流行病学调查

为了掌握青海省海北州牦牛血清中牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的流行情况,本试验分别采用ELISA方法和PCR方法对2015—2019年采集于青海省海北州的336份牦牛血清样品进行了BVDV和IBRV的抗体和抗原检测。结果表明,2015—2019年BVDV抗体阳性率分别为11.11%、17.19%、22.06%、26.67%和29.76%,IBRV抗体阳性率分别为8.89%、12.50%、13.24%、18.67%和19.05%,BVDV/IBRV抗体混合阳性率分别为0、3.13%、5.88%、6.67%和8.33%,BVDV阳性感染率分别为11.11%、14.06%、16.18%、20.00%和20.24%,IBRV阳性感染率分别为8.89%、9.38%、10.29%、14.67%和19.05%,BVDV/IBRV混合感染率分别为0、3.13%、4.41%、5.33%和5.95%。因此,自2015年开始青海省海北州牦牛群中存在BVDV和IBRV的流行,且BVDV和IBRV阳性感染率自2015—2019年存在逐步升高的趋势,尤其是2018年和2019年的BVDV和IBRV阳性感染率升高幅度均较大。

BVDV与IBRV二重二温式PCR检测方法的建立及应用

针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5′非翻译区(5′UTR)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的gB基因分别选取2对引物,建立这2种病毒的二重二温式PCR检测方法,该方法特异性高,可检出BVDV与IBRV,与牛轮状病毒等均无交叉反应;对BVDV与IBRV的最低检测质量浓度为1.32、0.047 mg/L。使用该方法对采集自宁夏地区的113份具有BVDV与IBRV临床症状的牛的粪便进行检测,结果显示BVDV与IBRV的阳性检出率分别为12.39%、22.12%,2种病原体混合感染的阳性检出率为7.08%。与单重二温式PCR检测结果进行比较,得出BVDV阳性符合率为93.33%,IBRV阳性符合率为92.53%,2种病原体混合感染的阳性符合率为100%。

PEI磁珠吸附IBRV主要囊膜蛋白基因的DNA疫苗的构建

通过利用实验已经构建好的表达IBRVgB/gC/gD囊膜蛋白的真核表达质粒(pCDNA4-gB-His、pCDNA4-gC-His、pCDNA4-gD-His)为免疫原,以PEI磁珠为载体,PEG为保护层构建DNA疫苗。将构建好的真核表达质粒,通过鉴定、扩增、大提后,使PEI磁珠与其吸附并转染至小鼠胚胎细胞(NIH/3T3)鉴定蛋白表达情况,此后进行疫苗制备并通过电镜观察其形态特征。结果表明:三种蛋白均能在小鼠细胞中表达,所制备DNA疫苗在电子显微镜下可观察到PEG包裹在最外层,粒径均在100 nm以内。成功构建了以PEI磁珠吸附IBRV gB gC gD基因并包裹PEG保护层的DNA疫苗,验证其在小鼠表达系统中可以成功表达,为后续对小鼠免疫效果的评价奠定了基础。

大青叶水提物对牛传染性鼻气管炎病毒的体外增殖抑制活性评价

旨在探究大青叶水提物对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)体外增殖抑制活性,为临床治疗IBRV感染提供新的参考依据。通过细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)和噻唑蓝(MTT)法,结合细胞病变(cytopathic effect,CPE)法确定大青叶水提物对牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cells,MDBK)的毒性作用,测得药物对细胞的最大安全浓度;将药物最大安全浓度以二倍稀释法稀释3个梯度,通过MTT法和CCK-8法检测大青叶水提物在不同给药方式下对IBRV的抑制活性;计算细胞存活率、药物有效抑制率、药物半数中毒浓度(50%cytotoxic concentration,CC50)和药物半数有效浓度(50%effective drug concentration,EC50),并以治疗指数(therapeutic index,TI)作为评价指标;通过病毒滴度、实时荧光定量PCR和免疫荧光染色法进一步确定大青叶水提物对IBRV增殖的抑制作用。结果表明,大青叶水提物对MDBK细胞的最大安全浓度为0.8μg·μL^(-1),半数中毒浓度(CC50)为1.937μg·μL^(-1),在最大安全浓度范围内药物浓度越高抑制效果越好;大青叶水提物在不同给药方式对IBRV均有抑制作用,中药和病毒预先作用、先接种病毒后加中药及先加中药后接种病毒三种给药方式的EC50分别为0.2928、0.3501、0.4161μg·μL^(-1),相应的TI分别为6.6154、5.5327、4.6551;通过病毒滴度、实时荧光定量PCR和免疫荧光染色发现,在中药和病毒预先混合作用下,病毒感染36 h药物对病毒抑制作用最显著。大青叶水提物有较好的抗IBRV活性,研究结果可为大青叶水提物在兽医临床应用和深入开发提供科学依据。

牛传染性鼻气管炎病毒胶体金检测试纸条的研制和评价

为建立快速检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的病原学检测方法,本试验采用杂交瘤细胞融合技术制备IBRV单克隆抗体,以其作为检测原,优化反应条件并组装IBRV胶体金检测试纸条,验证该试纸条的特异性、灵敏性、敏感性和稳定性,并与实时荧光定量PCR(qPCR)进行比较分析。结果显示,共制备7株针对IBRV的单克隆抗体,其中以胶体金标记的单克隆抗体2B7作为捕获抗体、1B9作为检测抗体,建立的胶体金检测试纸条能够检测样品中的IBRV;该试纸条与病毒性腹泻/黏膜病毒、牛冠状病毒和大肠杆菌无交叉反应,检测限为4.04×10~4TCID50/0.1 mL,敏感性为86.7%;在室温条件下保存12个月仍能够有效检测IBRV,说明该试纸条稳定性良好。与qPCR比较结果显示,2种方法检测结果的符合率为92.85%,说明该胶体金检测试纸条能够用于IBRV的临床诊断。结果表明,本试验利用IBRV的单克隆抗体建立的胶体金检测试纸条灵敏度高且特异性好,为IBRV抗原检测和流行病学调查提供技术支持。

牛传染性鼻气管炎病毒gG蛋白的表达及gG-ELISA的建立

以牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）基因组DNA为模板,PCR扩增gG基因,克隆到T载体pMD18-T,经限制性酶切分析及序列测定鉴定正确后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG。SDS-PAGE和Western blot分析表明,该基因在大肠杆菌BL21（DE3）中呈可溶性及包涵体两种形式表达,重组蛋白质具有免疫学活性。包涵体蛋白经提纯、变性、复性后,作为包被抗原建立了gG-ELISA诊断方法。应用该方法与进口试剂盒（IDEXX）平行检测380份血清样品,两种方法的符合率为92%（351/380）。对6份病毒分离阳性血清的检测均为阳性,对非相关病原的阳性血清及中监所的阴性血清检测均为阴性,表明所建立的IBRVgG抗体的ELISA检测具有良好的灵敏度与特异性。对1248份奶牛血清样本进行了检测,进口牛群的IBRV抗体阳性率平均为21.7%,湖北本地中国黑白花奶牛的抗体阳性率在不同牧场之间变化很大,范围为0.0%-41.5%。

牛病毒性腹泻病毒、牛传染性支气管炎病毒和口蹄疫病毒多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时快速鉴别检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性支气管炎病毒(IBRV)和口蹄疫病毒(FMDV)的方法,本研究根据高度保守的BVDV的5'UTR基因、IBRV的g B基因和FMDV的3D基因,分别设计了3对对应的特异性引物和3种不同发光基团标记的Taq Man探针,建立了同时检测这3种病毒的多重荧光定量PCR的方法。并对其反应条件进行优化。结果表明,该多重荧光定量PCR方法能够特异性检测出BVDV、IBRV和FMDV,而对BTV等检测结果均为阴性,对BVDV、IBRV、FMDV的最低检测量分别为194拷贝/μL、208拷贝/μL和150拷贝/μL。而且组内和组间变异系数均低于0.85%。本研究所建立的多重荧光定量PCR具有方便、快速、特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,能够用于BVDV、IBRV和FMDV的同时检测。

牛传染性鼻气管炎活疫苗安全性和免疫保护效果研究

本试验使用牛传染性鼻气管炎弱毒活疫苗进行安全性和免疫保护效果研究,将该疫苗分别接种1月龄犊牛、6～8月龄牛及后备母牛,接种剂量为2mL(10头份),检验疫苗安全性。将疫苗接种6～8月龄牛,接种剂量为1mL(1头份),疫苗接种后28d使用检验用强毒进行攻毒,检验疫苗对攻击用强毒的保护效力。结果表明,不同月龄牛接种疫苗后体温正常,无任何临床可见异常,后备母牛接种疫苗后精神状态及食欲均良好,无流产、死胎及木乃伊胎出现。疫苗接种牛对强毒攻击可产生较好的抵抗力,攻毒保护率达5/5。研究结果表明,该疫苗对牛安全,且免疫保护效果良好。

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测。结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应。本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测。

牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV )gB基因序列 ,应用 0ligo4.1程序设计一对引物PB1/PB2 ,分别对IBRVLA株、洛精、美精、BarthaNu/ 67株、B7株、云南 -1和云南 -2分离株进行了PCR扩增。结果显示 7株IBR病毒DNA均有 3 3 9bp的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒 (PRV)、马立克氏病毒 (MDV)、鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV)进行扩增 ,均未见特异性条带 ,证明该引物是特异的 ;检测PCR的敏感性表明 ,该法可检测出 3 pg的病毒DNA。

牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展

进行牛传染性鼻气管炎分子流行病学调查时,首先通过临床症状观察进行初诊,然后再进行实验室确诊。目前实验室诊断主要包括病原学诊断和血清学诊断。病原学诊断方法包括包涵体检查、病毒分离和病毒核酸检测;血清学诊断方法包括中和试验、琼脂扩散试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验和变态反应。有时还要进行鉴别诊断,鉴别诊断主要有单克隆抗体法、鉴别PCR等。牛传染性鼻气管炎在世界范围内流行,给全球的养牛业造成了很大的影响。论文综述了牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展,为预防和消除该病提供参考。

牛传染性鼻气管炎病毒套式PCR检测方法的建立

利用套式PCR技术建立一种快速检测牛传染病鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)并能区分野毒株和gB基因缺失疫苗的方法。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gB和gE基因序列,应用pri mer5.0软件设计了gB/BN和gE/EN的2套套式PCR引物,分别对IBRV标准株进行PCR扩增,结果表明,这2套引物均能扩增出与设计目的片段大小一致的特异性条带;用此引物对同属的伪狂犬病毒、马立克氏病毒、鸭瘟病毒进行扩增,具有良好的特异性。引物gB/BN和gE/EN的检测灵敏度分别为0.01TCID50和0.1TCID50。

奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651bp和431bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。

牛传染性鼻气管炎疫苗研究进展

牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)感染家养牛引起的一种热性接触性传染病。由于缺乏有效的治疗性药物,因此疫苗免疫仍然是防控该病的关键措施。针对该病常用的疫苗主要有灭活疫苗和活疫苗,而基因缺失活疫苗由于具有免疫标识,已成为新型疫苗研发的主流方向。一些发达国家已利用基因缺失标记疫苗,如IBRV gE缺失疫苗,进行免疫根除计划并净化了该病。然而,由于现存的疫苗仍存在免疫抑制与潜伏感染等问题,亟需研制更有效的标记疫苗。论文就牛传染性鼻气管炎病毒的病原学特征、免疫抑制及疫苗研发进展进行综述,以期为IBR有效疫苗的研发及其在防控上的应用提供参考。