SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病

[目的]利用SYBR-GreenI实时荧光PCR检测传染性鲑鱼贫血病。[方法]根据传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)Y10404的序列合成部分基因片段,将其插入到T载体中,构建阳性质控品;并设计合成一对特异性引物。利用阳性质控品建立SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法,对反应体系进行优化,进行特异性和敏感性分析,并制作标准曲线。[结果]最佳引物终浓度为0.5μmol/L。所建立的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR方法能够特异地检出ISAV;最低检出浓度为9.5×10-8μg/μL,其灵敏度比传统PCR高1000倍;能够从阳性样品中检出ISAV,Tm值为82.5℃。建立了标准曲线,其r2>0.99。

传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明,本研究建立了ISAV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,实验能对整个扩增过程进行实时监测,提高检测灵敏度的同时,防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。

进口冰鲜大西洋鲑鱼中缺失型传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV-HPRΔ)的鉴定

为确保从挪威进口至四川的冰鲜大西洋鲑鱼的卫生与安全,防止有害生物因子传入我国。本试验参照OIE及相关国内行业标准推荐的水生动物疾病诊断手册中分子生物学检测方法,采用TaqMan荧光定量RT-PCR结合HE基因中高度多态区域(HPR)克隆测序等诊断方法,对从挪威进口至四川成都的某批次抽检去内脏冰鲜大西洋鲑鱼进行传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)的检测。结果显示,该进口大西洋鲑鱼鱼肉中检出HPR缺失型ISAV,且其HPR区间存在51 bp的碱基缺失,基于HPR的序列分析结果提示其与分离自挪威的ISAV9和9/93 HPR缺失型ISAV的亲缘关系最近。结果表明,这是我国国内首例通过分子生物学方法,从进口大西洋鲑鱼鱼肉中检出HPR缺失型ISAV的案例,该结果警示各大水生动物检疫机构应重视对进口的去内脏冰鲜大西洋鲑鱼中ISAV的筛查,严防该病毒进入我国。

进口冰鲜大西洋鲑中传染性鲑鱼贫血症病毒的鉴定

传染性鲑鱼贫血症病毒(Infectious salmon anaemia virus,ISAV)作为一种对鲑鳟鱼类危害严重的病原,对世界鲑鳟养殖业造成较大经济损失。本研究依据世界动物卫生组织(OIE)推荐的方法,对2014年经深圳口岸进口的冰鲜大西洋鲑进行了ISAV检测,9批挪威进口冰鲜大西洋鲑被检出疑似ISAV阳性。然而,9批样品ISAV病毒分离结果均为阴性。基于ISAV血凝素酯酶(Hemaglutinin esterase,HE)基因序列的分析结果,9株ISAV均属于HPR非缺失型ISAV(HPR0ISAV),且与挪威ISAV分离株同源性达98.3%~100.0%。本研究共从491批冰鲜大西洋鲑中检出HPR0ISAV阳性9批,阳性检出率为1.8%。因此,应加强对挪威进口冰鲜大西洋鲑的检疫,以防HPR0ISAV传入我国。

鲑传染性贫血病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、定量的鲑传染性贫血病毒(ISAV)检测方法,基于ISAV片段7 ORF1编码的结构蛋白(NS)保守基因序列,设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化,建立ISAV的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,对其特异性、灵敏度及重复性进行评估,将其应用于口岸进境大西洋鲑报检样本ISAV检测中,并与OIE推荐的检测方法的检测结果进行比较。结果显示,本方法特异性强,灵敏度高,最低检测灵敏度达1.31×10~2copies/L。重复性试验结果显示,本方法的批内变异系数小于1%。299份2014—2016年间进口大西洋鲑报检样本的检测结果显示,ISAV的总检出率为6.35%(19/199),该结果与OIE推荐的检测方法的结果完全一致,且利用本方法测定的19份阳性样本的Ct值普遍低于OIE推荐检测方法测得的Ct值。结果表明,本研究中所建立的方法高效、敏感、特异、重复性好,在口岸检疫中具有广阔的应用前景,对于ISAV的鉴别诊断具有一定的参考意义。