10例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症分子发病机制与临床特性分析

目的 探讨 10例遗传性凝血因子Ⅶ (coagulationfactorⅦ ,FⅦ )缺陷症基因突变类型与临床特性。方法 检测凝血指标以明确诊断 ;用DNA直接测序法对先证者及其家庭成员FⅦ基因的全部外显子及其侧翼、5’和 3’非翻译区进行分析 ,寻找基因突变 ;将含插入或缺失突变序列克隆入pMD18 TTA克隆载体中 ,对所得两条染色体相应序列分别测序 ,以确定突变在染色体上的分布。应用限制性内切酶对先证者及家系成员相应基因片段进行酶切分析 ,无酶切位点改变的基因片段用等位基因特异的PCR(ASPCR)方法 ,证实测序所发现的突变。结果 在 10例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者中发现 8种类型的基因突变 ,其中 6 390T→C(Phe4 0Cys) ,94 82G→T(Arg15 2Leu) ,和 114 87 9delC 3种突变为国际首次报道 ;6种突变发生在催化区 ;除一种缺失突变外 ,其余均为点突变 ;所有的基因突变都来自先证者的父亲和 (或 )母亲。Thr35 9Met和Arg30 4Trp突变分别在 4个及 2个无亲缘关系的家系中重复出现。 2例Thr35 9Met纯合突变 (FⅦ :C分别为 2 %和 3% )及 1例Arg15 2Leu、114 87 9delC及Arg30 4Trp复合杂合突变 (FⅦ :C为 1% )临床表型为重型 ;2例双重杂合突变 (His348Gln和Thr35 9Met,Agr30 4Trp和Arg30 4Gln)临床表型分别为中型和无症状

遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症研究进展

遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺乏症是一种在临床上非常少见的出血性疾病,常与FⅦ基因缺陷有关,其临床表型往往与FⅦ基因的突变类型及突变区域密切相关。近年来国际上相继进行了几个较大的遗传性FⅦ缺乏症相关研究的合作项目,发现了新的基因突变,丰富了疾病相关基因突变数据库,而且在疾病基因治疗方面也取得了可喜的进展。

先天性Ⅶ缺乏症孕妇围产期凝血功能分析及治疗思路

目的分析1例先天性Ⅶ缺乏症孕妇围产期凝血功能并讨论治疗策略。方法对1例先天性Ⅶ缺乏孕妇围产期不同时间点的血液样本,采用凝固法测定患者血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆凝血酶时间(TT),采用Clauss凝固法测定血浆纤维蛋白原(Fbg)、采用胶乳免疫比浊法测定D-二聚体(DD)及抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)。结果围产期替代治疗前患者凝血功能指标表现为PT延长,Fbg轻度上升,其余指标正常,术前给予重组VII生物活性制剂,1 h内患者出现PT缩短,呈现高凝状态;术中患者凝血功能未发生紊乱;手术分娩后患者凝血功能逐渐变为异常,表现为PT延长,DD增高,术后3 d PT水平基本恢复到术前状态。结论围产期动态检测凝血功能指标,特别是PT的变化情况,对本例先天性Ⅶ缺乏孕妇行剖宫产分娩极为重要,同时结合其他凝血、纤溶指标可有效实时判断患者体内凝血功能状况。

双重杂合性突变Arg304Gln和Arg304Trp导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症

目的:探讨一例遗传性凝血因子Ⅶ(coagulation factor Ⅶ,FⅦ)缺陷症家系基因突变的类型。方法:检测凝血指标以明确诊断;用DNA直接测序法对先证者及其家庭成员FⅦ基因的全部外显子和其侧翼以及启动子进行分析,寻找基因突变;将含突变序列克隆入pGEM T—easy质粒载体中,对所得两条染色体相应序列分别测序,以确定不同突变在染色体上的分布。应用限制性内切酶MspⅠ对先证者及家系成员相应基因片段进行酶切分析,证实测序所发现的突变。结果:先证者在8号外显子上有两种基因突变:11348位C→T突变和11349位G→A突变。pGEM T—easy质粒克隆测序结果显示上述两种突变位于不同的染色体上。为不同染色体同一编码区Arg(CGG)304Trp(TGG)和Arg(CGG)304Gln(CAG)双重杂合性突变。其父亲、母亲分别为11349位G→A和11348位C→T杂合突变;先证者的弟弟FⅦ基因为正常野生型;其哥哥和3个子女均为杂合性突变。PCR辅助限制性酶切证实了先证者及其家系成员的基因突变。结论:先证者FⅦ基因突变为不同染色体同一编码区Arg304Trp和Arg304Gln双重杂合性突变,此种突变类型的组合尚属首例。

9例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者的基因诊断与表型分析

目的探讨9例遗传性凝血因子Ⅶ(FⅦ)缺陷症患者的基因突变类型与临床特征。方法采用一期法检测患者的FⅦ活性(FⅦ:C),用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其FⅦ抗原(FⅦ:Ag)水平,并抽提患者的外周血基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增FⅦ基因所有外显子及其侧翼序列,采用DNA直接测序进行基因分析。结果在9例遗传性FⅦ缺陷症患者中发现10种基因突变,包括3种剪切位点突变和7种错义突变。1例患者为p.Tyr128(68)Cys纯合突变,其FⅦ:C为0.8%,FⅦ:Ag为2.5%,临床表型为反复重度出血;5例患者携带FⅦ基因双杂合突变,分别为p.Thr241(181)Asn和p.Gly406(346)Asn、IVS1a+5G>A和p.His408(348)Gln、IVS5-1G>A和p.His408(348)Gln、c.*64G>A合并p.Ile213(153)Asn、p.Cys389(329)Gly和p.His408(348)Gln的双杂合突变,其相应的FⅦ:C分别为1.2%、4.4%、1.0%、0.5%和1.2%,患者临床出血症状轻重不一;3例患者携带杂合突变,分别为p.Cys389(329)Gly、p.His408(348)Gln和p.Thr419(359)Met,其FⅦ:C分别为0.5%、8.3%和9.4%,第1位有出血史,后2位无明显出血。结论在9例遗传性FⅦ缺陷症患者中发现了10种基因突变,其中p.Gly406(346)Asn、c.*64G>A、p.Ile213(153)Asn为新发现突变。p.His408(348)Gln突变较常见,而FⅦ:C与患者的临床表型间无相关性。

124例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者基因型与临床表型

目的探讨124例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者基因型、临床表型及二者间的关系。方法从PubMed、中国知网(CNKI)、维普中文科技期刊数据库、万方数据知识服务平台、中国生物医学文献数据库(CBM)搜集1981-2019年全部关于凝血因子Ⅶ缺陷症的文献,并筛选出符合标准的共计124例患者的临床资料进行回顾性分析。结果124例凝血因子Ⅶ缺陷症患者共有57种基因突变,高危出血基因型有Arg304Trp、Thr359Met、His408Gln、IVS5-1G>A、Arg277Cys、Arg152Leu、Tyr128Cys、Arg364Gln、27/28delCT、11520/11521insT、11487-9CCCdelC、26/27delTC;在纯合子患者中,出现中枢神经系统出血的是IVS5-1G>A、IVS6-1G>A基因型者;出现消化道出血的是IVS5-1G>A、Thr359Met、27/28delCT基因型者;出现关节血肿的是26/27delTC,Tyr128Cys基因型者。出血程度与构成基因的合子型有关(P=0.040);杂合子与纯合子的出血程度差异有统计学意义(P=0.036)。出血程度与凝血酶原时间(PT)、凝血因子Ⅶ活性(FⅦ:C)无关(P=0.320、0.326)。结论遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症在我国目前有57种凝血因子Ⅶ基因突变,12种高危出血基因型,出血程度与合子型有关,杂合子患者出血程度轻,纯合子患者出血程度重,出血程度与PT、FⅦ:C无关。

新生儿凝血因子Ⅶ缺乏症2例报告并文献复习

目的探讨新生儿期发病的遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症(FⅦD)的临床特征、诊断和治疗。方法对广州市妇女儿童医疗中心确诊的2例新生儿FⅦD的临床表现、诊治过程和基因检测情况进行回顾性分析,并通过复习相关文献,分析和总结有关国内外新生儿FⅦD的文献报道。结果 2例FⅦD患儿均为女性,临床表现为严重消化道和颅内出血,实验室特点为反复、非Vit K1依赖的凝血酶原时间(PT)持续延长,部分凝血酶原时间(APTT)正常,凝血因子Ⅶ活性分别为1.5%和3%,分别于31 d和6个月再次发生大面积颅内出血而死亡,基因检测证实均为F?基因IVS7+1G>T剪切位点纯合突变。文献复习共检索到22例新生儿期FⅦD,合并本文2例后共24例。24例均为足月,男女均可发病,多为生后7 d内发病(17/24,70.8%);首发症状依次为消化道出血9例、神经系统症状(嗜睡、抽搐和反应差等) 8例、皮肤苍白7例。颅内出血比例高(23/24); PT显著延长,Ⅶ因子活性明显下降(≤5%占83.3%);病死率及致残率高(70.8%); 14例经基因检测确诊。结论 FⅦD在新生儿期发病罕见,一旦发病,易发生致命性出血,预后不良。PT延长且不易纠正,Ⅶ因子活性显著下降即可临床诊断,F?基因某些位点突变可导致严重出血,基因诊断有助于产前诊断。

遗传性因子Ⅶ缺乏症一家系基因分析

目的 鉴定遗传性凝血因子Ⅶ (FⅦ )缺乏症一家系的FⅦ基因突变。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)分段从基因组DNA扩增出先证者及正常人的FⅦ基因各外显子DNA片段 ,经PCR产物直接测序法 ,分析各片段序列 ;采用PCR结合限制性内切酶HgiCI酶切分析先证者及其家系成员的FⅦ基因组DNA片段。结果 先证者的FⅦ基因第 32 9密码子存在TGT→GGT错义突变 ;限制性内切酶酶切的结果确证先证者为C32 9G纯合型突变 ,家系中有 3个成员为C32 9G杂合型突变。结论 在国内外首次发现存在于遗传性FⅦ缺乏症患者的FⅦ基因第 32 9密码子TGT→GGT突变 ,导致所编码的半胱氨酸被甘氨酸替代 ;PCR结合限制性内切酶HgiCI酶切分析可用于该突变的快速诊断。

纯合子His348Gln导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症家系分析

目的对1个姨表近亲结婚的遗传性凝血因子Ⅶ（coagulation factorⅦ，FⅦ）缺乏症家系进行基因突变检测，探讨其分子发病机制。方法检测凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间、纤维蛋白原、血浆凝血因子活性等指标以明确诊断；用DNA直接测序法对先证者及家系成员FⅦ基因的全部外显子及侧翼、5’和3’非翻译区进行分析，寻找基因突变，用反向测序证实所发生的突变。结果先证者PT（30．9s）和FⅦ活性（3％）明显异常，女儿、父亲和母亲的PT（分别为21．2s、16．3s和16．1s）稍延长和FⅦ活性（分别为22％、25％和35％）减低，胞弟各指标均在正常范围内；先证者FⅦ基因第8外显子的11482位为纯合T→G导致氨基酸His348Gln；女儿、父亲和母亲为His348Gln杂合子，胞弟为正常野生型。结论该遗传性FⅦ缺乏症家系为纯合子错义突变His348Gln，推测此突变遗传自近亲结婚具有该杂合子的父母。

四个遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系的基因与表型分析

目的研究4个遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺陷症家系的临床表型及基因突变。方法用一期法测定先证者及其家系成员的凝血酶原时间（PT）及FⅦ活性（FⅦ：C），用双抗夹心ELISA测定血浆中FVH抗原（FⅦ：Ag），用PCR结合测序分析各家系成员的基因突变情况。结果各家系先证者PT明显延长，FⅦ：C与FⅦ：Ag明显降低。家系1先证者FⅦ基因为18041T→G纯合性突变，使未成熟FⅦ（ProFⅦ）的408位组氨酸（His）变为谷氨酸（Gln）（成熟蛋白的His348Gln）；家系2先证者FⅦ基因测序发现5078—5079CT双碱基的纯合性缺失，致使阅读框改变，在ProFⅦ的N端25位提前终止；家系3先证者FⅦ基因分析发现15975G→A与18093C→T双重杂合突变，前者为内含子6的3’端剪接位点突变（IVS6—1G→A），后者为无义突变，致使ProFⅦ蛋白的426位提前终止；家系4先证者FⅦ基因测序发现15975G→A与17908G→A双重杂合突变，后者使ProFⅦ364位Arg→Gln。结论在4个遗传性FⅦ缺陷症家系中发现His408Gln与5078—5079del CT两个纯合突变及IVS6—1G→A、Gln426stop与IVS6—1G→A、Arg364Gln两个双重杂合突变。其中His408Gln与5078—5079del CT为国内首次报道的纯合突变，IVS6—1G→A、Gln426stop为国际首次报道的突变。

一个遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系的F7基因突变分析

目的对1个遗传性凝血因子Ⅶ（coagulation factorⅦ，FⅦ）缺陷症家系进行基因突变检测，并探讨F7基因突变与疾病发生的关系。方法检测先证者及其家系共16名成员的凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、血浆FⅦ活性（FⅦ activity，FⅦ：C）等指标以明确诊断；用DNA测序法分析先证者F7基因的全部外显子及侧翼序列、5’和3’非翻译区及家系成员相应的突变位点区域。结果先证者及其弟的PT、FⅦ：C明显异常，分别为39．0s、2％和30．1 s、3％；先证者祖母、外祖母、二姑、父亲、母亲、舅舅和二姨的FⅦ：C分别为68％、54％、71％、73％、62％、72％和59％，均稍低于正常对照水平（80％～108%）；先证者及家系成员的其他凝血表型指标均在正常范围。测序结果显示先证者及其弟的F7基因第8外显子发生了g．11349G＞A和g．11482T〉G复合杂合突变，分别导致p．Arg304Gln和p．His348Gln错义突变;先证者外祖母、母亲、舅和二姨4名母系成员均存在F7基因第8外显子g．11349G＞A杂合突变，先证者祖母、父亲和二姑3名父系成员均存在F7基因第8外显子g．11482T〉G杂合突变，家系其他成员F7基因均为正常野生型。结论该遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系先证者的F7基因存在g．11349G＞A（p．Arg304Gln）和g．11482T＞G（p．His348Gln）复合杂合突变，且分别遗传自其母系家族和父系家族。F7基因g．11349G＞A（p．Arg304Gln）和g．11482T＞G（p．His348Gln）杂合错义突变与该家系的FⅦ活性水平降低有关。

非经典的剪接位点(IVS1a+5g>a)及His348Gln双杂合突变导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症

目的 探讨遗传性凝血因子Ⅶ (FⅦ )缺陷症分子发病机制。方法 检测凝血指标以明确诊断 ;用DNA直接测序法对患者FⅦ基因的全部外显子和其侧翼以及 3′ ,5′非翻译区进行分析 ,寻找基因突变 ,对有突变的序列反向测序证实 ;发生在非经典的剪接位点突变用外周血单个核细胞异位转录的RT PCR方法确定其剪接方式。结果 患者在 8号外显子 10 96 1位发生T→G杂合突变 ,导致 348位His被Gln替代 ;在 1号内含子 5′端的非经典的剪接位点有Ggtgcg >Ggtgca(IVS1a+5g >a)杂合突变 ,RT PCR结果揭示剪接过程中去除了 2号外显子 ,却把 3号内含子包含进去 ,在 3号外显子起始处出现了移码突变 ,编码与原来氨基酸完全不同的 9个氨基酸后出现了终止信号 ,产生了一个只有 30个氨基酸组成的截短型蛋白。结论 患者FⅦ基因中发现了两种杂合突变 (10 96 1位T→G、IVS1a +5g >a) ,其中后一种非经典的剪接位点突变导致的异常剪接方式为国际首次报道。

遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症的分子发病机制研究

目的对一个遗传性FⅦ缺乏症家系进行F7基因突变检测，探讨其分子发病机制。方法采用ELISA法检测先证者及家系成员FVII：Ag，采用一期凝固法检测先证者及家系成员Frr、FVU：C等凝血指标进行实验表型诊断。基因检测采用DNA直接测序法分析先证者及家系成员F7基因的全部外显子及侧翼、5’和3’非翻译区，发现突变位点用反向测序加以证实；用CLCProtein Workbench软件分析基因突变位点的物种保守性和蛋白质二级结构改变。选择100名健康对照者以排除基因多态性。结果先证者及其妹妹的PT、FⅦ：C、FVII：Ag明显异常，分别为36．3s、5．0％、40．7％和33．4s、5．0％、37．4％；先证者的父亲、母亲、女儿、外甥女的门稍延长，分别为14．9s、14．6S、15．5S、14．6s；其FⅧ：C稍减低，分别为70％、85％、59％、79％。先证者F7基因8号外显子c．784T〉C杂合突变导致Ser269Pro，8号外显子c．964T〉G杂合突变导致Cys329Gly；先证者妹妹为c．784T〉C和c．964T〉G双重杂合突变，母亲为C．784T〉C杂合子，父亲、女儿、外甥女均为C．964T〉G杂合子。蛋白质生物学特性分析发现，Cys329Gly导致蛋白质空间构型发生改变，Ser269Pro导致氨基酸极性及疏水性发生改变。结论F7基因Ser269Pro和Cys329Gly双重杂合突变是导致该例遗传性FⅦ缺乏症的分子发病机制。

重型遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系分子遗传学分析

目的 探讨遗传性凝血因子Ⅶ (FⅦ )缺陷症家系基因突变的类型。方法 检测凝血和止血指标以明确诊断 ;用DNA直接测序法对先证者及其家庭成员FⅦ基因的全部外显子及其侧翼、5′和 3′非翻译区进行分析 ;将含杂合缺失突变外显子克隆入pMD18 TTA克隆载体中 ,对来自父母的两条染色体的相应序列分别测序。应用限制性内切酶StuI、MspI进行酶切分析。 结果 先证者FⅦ的 6号、8号外显子分别发现了 1个错义杂合突变 :94 82位G→T ,导致Arg(CGA) 15 2被Leu(CUG)替代 ;11348位C→T突变 ,导致Arg(CGG) 30 4Trp(UGG)突变 ;克隆的 pMD18 TTA克隆载体测序结果显示一个杂合缺失 :在 114 87～ 9位 (CCC)缺失一个C ,引起框移突变 (已证实 ,后两种杂合突变均来自母亲 ) ,使 35 1位His变为Thr,在其后编码与正常氨基酸序列完全不同的 6个氨基酸后出现了翻译终止密码。其中 ,先证者Arg15 2Leu杂合突变来自父亲 ,其祖父具有相同的杂合突变 ,父亲还含有Arg35 3Gln杂合多态性 ;其祖母为Arg30 4Trp杂合突变且含有Arg35 3Gln杂合多态性 ;姑姑和大伯分别为Arg35 3Gln杂合多态性和Arg30 4Trp杂合突变。PCR辅助限制性酶切证实了先证者及其家系成员的两种错义突变。结论 在该例家系中发现了Arg30 4Trp、Arg15 2Leu、114 87～ 9位

一个遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系两种新的基因突变

目的探讨遗传性凝血因子Ⅶ（FⅦ）缺陷症的分子发病机制。方法用DNA直接测序法对1例FⅦ缺陷症家系成员FⅦ基因进行分析；将含突变序列克隆插入pMD19-TSimple TA载体中，对所得两条染色体相应序列分别测序，以确定不同突变在染色体上的分布。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和凝固法检测血浆中FⅦ：Ag和FⅦ：C。结果家系中有3种基因突变：第8号外显子第15386位核苷酸存在A→C（Arg353Pro）和第15386位核苷酸G→C（Gln353Pro）突变；第8号外显子第15274位核苷酸A→T（Lys316Stop）突变，家系成员中发现的这3种突变均为杂合子；发现先证者父亲存在3种杂合多态性：即启动子区2050～2059位CCTATACCT10bp的缺失／插入多态性、1号内含子IVSla＋9G→A及第15386位A→G（Arg353Gln），且均来自先证者祖父，3种多态性位于同一条染色体上。结论发现该家系存在1种FⅦ基因的错义突变（Gln353Pro）；1种无义突变（Lys316Stop），这两种突变均为国际上首次报道的新突变。

Arg304Trp导致的遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症家系分析

目的对1例姨表近亲结婚的遗传性凝血因子Ⅶ(coagulation factorⅦ,FⅦ)缺陷症家系进行表型与基因型分析。方法检测血浆中凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、FⅦ促凝活性(FⅦprocoagulant activity,FⅦ:C)及其它凝血指标以明确诊断;用DNA直接测序法对先证者及家庭成员FⅦ基因的全部外显子及其侧翼、启动子区进行分析,寻找基因突变,用反向测序证实所发现的突变。结果先证者的PT和FⅦ:C明显异常,分别为35.1s和3%;其父亲、母亲、大儿子和小儿子的PT稍延长,FⅦ:C明显降低。先证者FⅦ基因外显子8存在11348C→T纯合突变导致Arg304Trp;其父亲为该突变位点的杂合子,其母亲、大儿子和小儿子均为Arg304Trp杂合突变和Arg353Gln杂合多态性。结论先证者纯合突变Arg304Trp遗传自近亲结婚且具有相同杂合突变位点的父母。Arg353Gln多态性可能不是影响该家系成员血浆FⅦ:C水平的主要因素。

分析1个遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的基因新突变

目的探讨1个凝血因子Ⅺ(FⅪ)基因新突变致遗传性FⅪ缺陷症家系临床出血的分子机制。方法选取2023年2月23日因"腺样体肥大"就诊于山西医科大学附属运城市中心医院的1例遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症男性先证者及其家系成员(3代5人)作为研究对象。收集先证者及家系成员的临床资料;检测所有成员相关凝血指标;选取凝血指标异常[活化部分凝血活酶时间(APTT)延长, 凝血酶时间(PT)与纤维蛋白原(Fib)正常]者进行APTT纠正实验;选取纠正后罗斯纳指数(RI)小于10%者用一步法检测FⅪ活性(FⅪ:C)、用ELISA法检测FⅪ抗原(FⅪ:Ag)、用Illumina 测序法测定全外显子序列。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)相关变异评级指南对新突变位点进行评级, 用生物信息学软件预测新突变对蛋白质结构及功能的影响。结果先证者及其父亲、女儿的APTT均延长且RI小于10%;进一步检测发现3人FⅪ:C与FⅪ:Ag均降低;Illumina测序发现3人FⅪ第11号外显子存在c.1223dupC(P.Ser409Leufs*32)新的移码突变, 先证者父亲FⅪ第11号外显子还存在c.G1253T(p.Gly418Val)错义突变;ACMG对新突变的评级为:致病性变异, c.G1253T为已报道的可能致病变异。结论 FⅪ第11号外显子c.1223dupC(P.Ser409Leufs*32)杂合移码突变可能为该家系致病的主要分子机制。

双重杂合性突变Arg304Gln和Arg304Trp导致的遗传性凝血因子缺陷症

目的 探讨 1例遗传性凝血因子 (coagulation factor ,F )缺陷症及其家系基因突变的类型。方法 检测凝血指标以明确诊断 ;用 DNA直接测序法对先证者及其家庭成员 F 基因的全部外显子和其侧翼以及启动子进行分析 ,寻找基因突变 ;将含突变序列克隆入 p GEM T- easy质粒载体中 ,对所得两条染色体相应序列分别测序 ,以确定不同突变在染色体上的分布。应用限制性内切酶 Msp 对先证者及家系成员相应基因片段进行酶切分析 ,证实测序所发现的突变。结果 先证者在第 8外显子上有两种基因突变 :11348位 C→ T突变和 11349位 G→ A突变。 p GEM T- easy质粒克隆测序结果显示上述两种突变位于不同的染色体上。为不同染色体同一编码区 Arg(CGG) 30 4 Trp(TGG)和 Arg(CGG) 30 4 Gln(CAG)双重杂合性突变。其父亲、母亲分别为 11349位 G→ A和 11348位 C→ T杂合突变 ;其弟弟 F 基因为正常野生型 ;其哥哥和先证者的 3个子女均为杂合性突变。聚合酶链反应辅助限制性酶切证实了先证者及其家系成员的基因突变。结论 先证者 F 基因突变为不同染色体同一编码区 Arg30 4 Trp和 Arg30 4 Gln双重杂合性突变 ,此种突变类型的组合尚属首例。

遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症一例家系基因缺陷研究

目的分析1例遗传性凝血因子Ⅺ（FXI）缺陷症家系表型和分子遗传学特征，对凝血因子基因（F11）进行基因缺陷研究。方法通过检测先证者及家系成员的活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、FⅪ促凝活性（FⅪ：C）和FⅪ抗原（FⅪ：Ag）等进行临床表型诊断，应用PCR对先证者F11基因15个外显子及其侧翼序列进行扩增，对PCR产物进行直接测序。对先证者及其父母、100名健康对照者DNA相应区域进行PCR扩增，内切酶BssSI酶切，以排除基因多态性并确认突变位点。应用分析软件SignaIP对信号肽切割点及位置进行预测。结果先证者APTT为69．58，PT为12．3s，FⅪ：C为2．6％，FⅪ：Ag为2．5％，交叉反应物质（CRM）为阴性；健康对照组APTT为35s，PT为13s，FⅪ：C为100％，FⅪ：Ag为100％。测序发现，先证者F11基因外显子区共有4处与GenBank AY191837序列不同的位点，其中外显子2的G3733C杂合变异导致编码信号肽的氨基酸G-1R替换，该突变同时导入1个新的BssSI酶切位点。100名健康对照者的BssSI酶切结果排除了该变异为F11基因多态性。外显子8的C16642T杂合突变导致1个终止密码（Q263Term）产生。结论F11基因G-1R和Q263Term双重杂合突变是导致先证者遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症的分子发病机制。

一个遗传性凝血因子ⅩⅢ缺陷症家系新的基因异常

目的对1例遗传性凝血因子ⅩⅢ(ⅩⅢ)缺陷症家系进行基因分析,探讨其发病的分子机制。方法用尿素溶解法和 Berichrom kit 检测患者及其家系成员血浆 FⅩⅢ的活性,用火箭电泳和酶联免疫吸附试验测定 FⅩⅢ抗原含量。PCR 法扩增 FⅩⅢA 基因的所有外显子和侧翼序列,DNA 测序分析基因异常,用直接测序法和限制性内切酶(SfaN Ⅰ、Nsp Ⅰ)分析80名正常人相应序列的 PCR 产物以排除基因多态性。应用生物信息学软件对所鉴定的突变进行分子模建,探讨其致病的分子机制。结果患者纤维蛋白凝块住5mol/L 尿素中30min 内完全溶解,加入正常人血浆后则24 h不溶解,患者血浆FⅩⅢ活性为0,FⅩⅢA 抗原含量<2%,FⅩⅢB 抗原含量在正常范围。家系成员中其父母和外祖母血浆 FⅩⅢ活性和 FⅩⅢA 抗原约为正常人一半。在患者 FⅩⅢA 因因外显子15中发脱两处杂合异常,分别位于177 246位碱基(C→T,导致 Arg703→Trp)和177 286位碱基(A→G,导致 His716→Arg),直接测序和酶切分析两种方法均排除了基因多态性。患者的母亲与外祖母为 Arg703→Trp 杂合子,患者的父亲为His716→Aug 杂合子。分子模建分析表明,Arg03和 His716两个位点突变后均可导致 barrel 2与 core结构域之间距离和结合能力的改变,使蛋白质发生错误折叠,稳定性降低。His716→Arg 还可能影响酶的催化活性基因的空间结构形成。结论 FⅩⅢA 基因外显子15上 Arg703→Trp、His716→Arg 复合杂合突变影响了蛋白质的正确折叠和稳定性,造成患者 FⅩⅢ抗原和活性的缺失。此复合杂合错义突变是一种未报道过的新的突变类型。