人类microRNA-1246慢病毒抑制载体的构建以及鉴定

目的:构建microRNA-1246慢病毒抑制载。方法针对microRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段,应用基因重组技术将目的基因片段克隆到GV280慢病毒载体中,通过酶切、PCR、DNA测序验证重组克隆的成功构建,将GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒,浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度,用病毒液感染siha细胞,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)验证GV280-mir-1246down在siha细胞的表达情况,用嘌呤霉素筛选GV280-mir-1246down稳转细胞株。用细胞计数的方法检测细胞的生长率。结果①对菌落进行PCR鉴定筛选出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确;②GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共转染293T细胞产生重组慢病毒;③目的mir-246down被慢病毒成功导入siha细胞中,同时达到稳定表达,转到率几乎达100%,荧光显微镜下能直接观察到GFP;④细胞计数结果显示在siha细胞中microRNA-1246的下调细胞的生长速度减弱。结论成功构建microRNA-1246慢病毒抑制载体,建立siha细胞mir-1246-down的稳转株,microRNA-1246在siha细胞中下调的siha细胞的增殖能力下降.这为研究microRNA-1246在宫颈鳞癌siha细胞的作用及其机制提供了可靠的基础。

人类微小RNA-1246慢病毒抑制载体的构建及对宫颈鳞癌细胞增殖和侵袭的影响

目的构建并鉴定微小RNA(miRNA)-1246慢病毒抑制载体,并探讨miRNA-1246下调对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响。方法针对miRNA-1246成熟体的反义核苷酸片段设计引物并合成目的基因miRNA-1246-down,应用基因重组技术将目的基因克隆到空载质粒GV280中,通过酶切、PCR、DNA测序验证重组慢病毒质粒(GV280-miRNA-1246-down)的构建是否成功,将GV280-miRNA-1246-down、Helper 1.0、Helper 2.0共转染293T细胞获得重组慢病毒,浓缩提纯病毒液并检测病毒滴度,再用重组病毒液感染宫颈鳞癌细胞Si Ha,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)验证GV280-miRNA-1246-down在Si Ha细胞的表达情况,用嘌呤霉素筛选GV280-miRNA-1246-down稳转细胞株。将Si Ha细胞分为空白组(NC组)、阴性病毒组(NC-LV组)、miRNA-1246下调组(miRNA-1246-down-LV组),用细胞计数的方法检测细胞的生长率,用Transwell检测细胞侵袭能力。结果 (1)对菌落进行PCR鉴定筛选构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确。(2)慢病毒将目的基因miRNA-1246-down成功导入Si Ha细胞中,同时达到稳定表达,转染率达90%以上,在荧光显微镜下能直接观察到GFP。(3)miRNA-1246-down-LV组Si Ha细胞增殖数低于其他两组(P<0.05),细胞穿膜次数较其他两组减少(P<0.05)。结论 miRNA-1246慢病毒抑制载体构建成功,miRNA-1246稳定下调的Si Ha细胞株建立成功。在Si Ha细胞中miRNA-1246下调可抑制宫颈鳞癌Si Ha细胞的增殖以及侵袭能力。

小鼠microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体的构建及鉴定

目的构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体。方法设计针对microRNA-150前体的过表达基因片段及针对microRNA-150成熟体的反义片段,应用基因重组技术将目的基因片段克隆到pWPI慢病毒载体中,并进行DNA测序鉴定重组克隆。结果菌落PCR筛选鉴定出构建正确的慢病毒载体,DNA测序证实插入的基因序列正确。结论成功构建microRNA-150慢病毒过表达载体及抑制载体,为研究microRNA-150在肝再生中的作用及其机制提供了稳定的细胞转染载体。