欧洲黑杨转基因稳定性及对土壤微生物的影响

利用PCR分析技术 ,分析了田间试验已达 7a的转Bt基因欧洲黑杨的基因稳定性 ,并对其林地和非转基因林地的土壤微生物进行了类群数量分析。PCR分析表明Bt基因仍然存在于转基因植株中 ,转基因植株与对照杂交后代Bt基因分离呈 1∶1比例 ,符合孟德尔遗传分离规律 ,表明基因仍稳定存在。计数结果表明转基因林地中转基因植株与非转基因植株间根系土壤 3大类微生物 (细菌、放线菌和霉菌 )数量无显著差异 ,转基因林地与非转基因林地 (邻近杨树林地和健杨林地 )间的土壤 3大类微生物 (细菌、放线菌和霉菌 )数量无显著差异 ,说明转基因欧洲黑杨对土壤微生物系统尚没有明显的影响。

小黑杨转双价抗虫基因的研究

用根癌农杆菌介导的叶盘法,将蜘蛛杀虫肽与Bt基因C肽序列的融合基因导入小黑杨(Populus simonii×P.nigra),所获得的3株卡那霉素抗性再生植株进行PCR和PCR-Southern杂交检测的结果均为阳性,Southern杂交检测的结果2株为阳性。抗虫试验结果显示,3个转基因株系均具有明显的抗虫效果,能显著抑制舞毒蛾幼虫的生长发育,表现出强烈的抗虫作用。

抗虫转基因欧洲黑杨的Western印迹法分析

抗虫转基因欧洲黑杨的Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析陈颖，李强，李玲，韩一凡，田颖川（中国林业科学研究院林业研究所北京１０００９１）（中国科学院微生物研究所北京１０００８０）关键词Ｂｔ．基因，转基因欧洲黑杨，Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法ＷＥＳＴＥＲＮＢＬＯＴＡＮＡＬ...

转betA基因小黑杨的耐盐性分析及优良转基因株系的选择

在前期获得13个小黑杨转胆碱脱氢酶基因(betA)株系的基础上,选择9个生长正常的转基因株系与非转基因对照,用0、100、140、170、200mmol·L-15种浓度的NaCl处理盆栽苗木,分2、7、12、17、22d取处理材料叶片,测定转基因株系叶片中外源基因的最终合成产物———甜菜碱含量。盐处理60d后,测定苗木高度及转基因株系的盐害指数。结果表明,转基因株系与对照间的甜菜碱含量差异达到极显著水平,9个转基因株系的甜菜碱平均含量超过对照的27.1%;转基因株系的平均盐害指数较对照低15.8%;转基因株系的平均高度超过对照44.1%。综合转基因株系的生长速度,兼顾其耐盐性,初步选择转基因株系T4、T6、T5、T1作为生长速度快耐盐性高的优良株系。

抗虫转基因欧洲黑杨苗期光合特性研究

以抗虫转基因欧洲黑杨和非转基因欧洲黑杨无性系对照为研究材料,比较研究了其扦插苗在盆栽条件下苗期的光合生理特性及叶绿素荧光特性的差异,目的是了解外源基因的导入是否对欧洲黑杨的光合作用产生了非预期效应。结果表明:除了Ci和Fv/Fm外,转基因欧洲黑杨和对照在其他光合指标间差异均未达到显著水平。转基因欧洲黑杨和对照的净光合速率(Pn)日变化均表现为双峰曲线,但Pn的峰值大小和出现时间各异,光合"午休"的起始时间及持续时间也不尽相同;经相关性检验表明,转基因欧洲黑杨的Pn与胞间CO2浓度(Ci)、气孔导度(Gs)及蒸腾速率(Tr)呈极显著正相关(P<0.01),而对照仅有Gs日变化曲线与Pn日变化曲线基本一致,Ci、Tr与Pn变化趋势并不一致,无相关性;转基因欧洲黑杨的光合"午休"现象主要是由气孔限制因素引起的,而对照的"午休"现象则是气孔因素与非气孔因素共同作用的结果。同时,转基因欧洲黑杨与对照光合-光响应曲线的各项参数中,只有暗呼吸速率(Rd)之间达到了显著性差异(P<0.05),其中,对照要比转基因欧洲黑杨高52.8%,表明对照的生理活性较高。与对照相比,转基因欧洲黑杨表现出随着光强的增加,Fv/Fm值逐渐下降的趋势,14:30左右达到一天的最低值(0.78),说明持续的光照对其叶片PSⅡ最大光化学转化效率产生了一定的抑制作用,至17:00左右并未恢复到早晨的正常水平,表明其光合机构出现一定程度的光化学效率下调。总体来说,外源Bt基因没有对转基因杨树苗期的光合特性产生非预期的效应。

一年生转Bt基因欧洲黑杨对土壤微生物的影响

利用PCR技术检测欧洲黑杨植株内转入Bt基因的稳定性,连续1 a对苗期转Bt基因和其林地间及根际土壤中3大类微生物(细菌、真菌和放线菌)进行选择性培养和数量统计分析,并将经过辐射杀菌的转Bt基因欧洲黑杨和其落叶干粉加入培养基,分别对已知细菌、霉菌和放线菌培养并对其数量和生长情况进行了对比分析。结果表明:(1)Bt基因稳定存在于苗期转Bt基因欧洲黑杨植株内。(2)转基因和对照林地间及根际土壤中微生物数量在不同月份无显著差异。(3)转基因植株落叶干粉对已知微生物的培养结果与对照组无显著差异。从而得出:苗期转Bt基因欧洲黑杨林对土壤微生物尚没有明显的影响。

TA29-Barnase基因导致抗虫转基因欧洲黑杨雄性不育的研究

取在１／２ＭＳ＋ ＮＡＡ０－０２ ｍｇ／Ｌ 培养基中发育４ ～６ 周的欧洲黑杨转Ｂｔ 基因植株１５ｎ１９２ 试管苗幼叶，在ＭＳ＋ ＢＡ０－２ ｍｇ／Ｌ＋ ＮＡＡ０－０２ ｍｇ／Ｌ培养基中培养１６ｈ ，分别用基因枪法和叶盘法转化ＴＡ２９Ｂａｒｎａｓｅ嵌合基因，其Ｂａｒｎａｓｅ 基因的转化率依次为１６－１ ％ 和２３ ％ ，再生株数分别为１７５／１２ 和７１／１０ 。试验表明，选择发育适宜的叶片，利于目的基因转化后的植株再生。进一步用ＳＤＳ 法提取转基因植株总ＤＮＡ，经ＰＣＲ 检测表明：转化植株基因组中扩增出的ＤＮＡ 片段与Ｂａｒｎａｓｅ 基因的大小一致；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ 分析出转化后的欧洲黑杨基因组中携有Ｂａｒｎａｓｅ 基因片段，进行Ｄｏｔ Ｂｌｏｔ 检测，转化植株有一明显的杂交斑，并证实为阳性转化植株，并通过试管培养，结合林木常规育种方法，获得了转Ｂａｒｎａｓｅ 基因的抗虫欧洲黑杨转基因植株。

转基因单倍体小黑杨对天幕毛虫的抗性分析

以转基因单倍体小黑杨对天幕毛虫幼虫抗性进行研究,结果表明:该转基因小黑杨可延缓天幕毛虫幼虫发育,与对照相比转基因株系TT1和TT3分别使1～3龄的幼虫发育延缓1.24d和2.92d;取食TT18～19d的幼虫平均体质量与对照相比下降1.42%～17.37%、取食TT38～19d幼虫平均体质量下降10.77%～24.80%;取食TT14～18d的幼虫校正死亡率为9.52%～49.32%、取食TT34～18d的幼虫校正死亡率为11.11%～52.70%;取食转基因植株TT1幼虫的蜕皮指数2.969～3.769、毒力为0.010～0.026,取食转基因植株TT3幼虫的蜕皮指数2.906～3.714、毒力为0.032～0.041。

盐胁迫下8个转基因小黑杨株系的抗逆性比较

以3种转基因(codA、betA、lea)小黑杨(Populus simonii×P.nigra)为材料,选取XC1、XB1、XB2、XB3、XL1、XL5、XL6、XL11共8个株系,非转基因小黑杨为对照,对其进行浓度为0.8%的NaCl胁迫处理,胁迫第6天分别测定叶绿素含量及主要生理指标。结果表明:各转基因株系的平均叶绿素含量高于对照小黑杨的7.9%;POD活性、CAT活性、APX活性都高于对照;膜的损伤程度低于对照;XL1、XL5、XL6、XB4的SOD活性高于对照。总体表现为转基因小黑杨在膜的伤害程度上低于对照,在抗氧化能力上高于对照。

抗虫转基因欧洲黑杨叶片水浸提液的生物效应

为了研究抗虫转基因欧洲黑杨可能产生的非预期效应,为其生物安全评估提供进一步的数据支持,以蒸馏水为对照,通过叶片浸提法测定了非转基因欧洲黑杨鲜叶片及转基因欧洲黑杨鲜叶片水浸提液对小麦、胡萝卜、白菜、油松等植物种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明:非转基因欧洲黑杨和转基因欧洲黑杨的叶片水浸提液化感作用都不是十分强烈,且两者的化感作用具有选择性。浸提液在高质量浓度下对部分供试植物(双子叶植物:胡萝卜、白菜;裸子植物:油松)的种子萌发与对照相比表现出了明显的抑制作用,但对单子叶植物小麦种子的萌发并无明显的抑制作用。在对供试种子根生长和苗高的表现上,当受体植物为小麦和油松时,二者与对照相比均无显著的差异;但当受体植物为胡萝卜和白菜时,二者的水浸提液在高质量浓度下与对照相比表现出了明显的抑制作用。与非转基因欧洲黑杨相比,转基因欧洲黑杨的鲜叶片水浸提液化感能力并未因转入B t基因后而发生明显的改变,其对供试种子的萌发、根生长、幼苗生长等方面的负面影响程度比非转基因欧洲黑杨还要弱。

转基因欧洲黑杨土壤微生物状况和酶活性分析

对转基因欧洲黑杨林地和邻近黑杨林地的土壤微生物状况和酶活性进行了分析。结果表明转基因林地中转基因植株与非转基因植株间根系周围土壤3大类微生物(细菌、放线菌和霉菌)数量和酶活性无显著差异,转基因林地与邻近林地土壤3大类微生物(细菌、放线菌和霉菌)数量和酶活性无显著差异,初步说明转基因欧洲黑杨对土壤生态系统尚未造成明显的影响。

抗虫转基因欧洲黑杨多重PCR技术检测体系构建

根据抗虫转基因欧洲黑杨中的CaMV35S启动子、NOS终止子、NPTⅡ标记基因以及Bt目的基因序列,设计合成了相应引物,采用单重PCR和多重PCR技术对启动子、终止子、选择标记基因以及目的基因等多个外源基因进行检测,并对各引物的退火温度及引物之间的浓度配比进行优化,建立了适用于抗虫转基因欧洲黑杨检测的Bt、NPTⅡ和NOS基因的三重PCR分析的技术体系。结果表明:当各组引物的终浓度配比为1.0∶0.5∶0.5,退火温度为59℃时,所建立的三重PCR检测体系能够有效地检测出抗虫转基因欧洲黑杨中的转基因成分,实现了对抗虫转基因欧洲黑杨的快速、高效、准确的鉴定。

转BtCry1Ac欧洲黑杨的外源基因插入位点分析及特异性检测

【目的】分析转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因插入位点,从而进一步完善抗虫转基因杨树的背景信息,推进抗虫转基因杨树的安全评价及应用。【方法】以转BtCry1Ac欧洲黑杨株系n12、n222为试验材料,使用高效热不对称交错PCR法(hiTAIL-PCR)分离外源基因插入位点侧翼序列,比对毛果杨基因组序列确定插入位点。根据插入位点处的侧翼序列设计2对特异性PCR检测引物,建立转BtCry1Ac欧洲黑杨外源基因特异性PCR检测方法,并利用实时荧光定量PCR技术分析插入位点周边基因表达情况。【结果】PCR及半定量PCR结果表明,转基因欧洲黑杨株系的BtCry1Ac基因稳定表达。通过比对毛果杨基因组序列确定转基因杨n12 T-DNA插入基因组Chr15的10162773位点即Potri.015G076600第2个内含子,其碱基组成AT含量为65%;n222整合位点为基因组Chr01基因间隔区41596184位点,其碱基组成AT含量为69%。特异性PCR检测显示,n12能扩增出709 bp(转基因)和1159 bp(非转基因)特异性条带,n222及其与丹红杨杂交子代能扩增出1265 bp(转基因)和1827 bp(非转基因)特异性条带,而对照仅能扩增非转基因特异性片段。n12 T-DNA插入造成插入位点的丝氨酸蛋白激酶(SPK)Potri.015G076600基因表达量上调4.3倍,而附近的共济失调毛细血管扩张症突变蛋白(ATM)Potri.015G076700表达量下调20倍,从而可能调节杨树生长速度。n222插入位点上下游基因异黄酮-7-O-β-葡萄糖苷6″-O-丙二酰转移酶(IBG)Potri.001G395700和光敏色素互作因子解旋酶(PIF)Potri.001G395800表达量均上调。【结论】转BtCry1Ac欧洲黑杨T-DNA偏好插入富含AT区域,同时T-DNA载体边界序列缺失,并引起插入位点附近基因表达量变化。建立转BtCry1Ac欧洲黑杨特异性检测方法,为转BtCry1Ac欧洲黑杨的管理与监测提供参考。

转cry1Ac基因欧洲黑杨对赤子爱胜蚓生长发育和生殖的影响

【目的】调查转cry1Ac基因欧洲黑杨(世纪杨)对土壤指示生物蚯蚓生长、繁殖和体内生物酶活性的影响,为转基因杨树大规模应用提供生态安全方面的数据。【方法】以非转基因杨树为对照,将转基因欧洲黑杨(世纪杨)叶片添加到土壤中连续喂养赤子爱胜蚓140天,每隔14天调查蚯蚓存活情况,测定蚯蚓体质量变化,统计蚯蚓繁殖产生蚓茧数量及蚓茧孵化情况,在蚓茧孵化7天后和成蚓暴露140天后测定蚯蚓体内总蛋白、乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽过氧化物酶(GST)和超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化。【结果】与对照杨树相比,饲喂转基因杨树叶片的蚯蚓存活率未发生显著改变;各处理组蚯蚓的体质量随试验进行而增加,140天10次调查中转基因杨树和对照杨树处理组蚯蚓体质量均无显著性差异;转基因杨树和对照杨树处理组均于试验第2次调查(28天)时开始繁殖,整个试验期转基因杨树和对照杨树处理组单条蚯蚓产蚓茧数无显著性差异,42~140天8次调查中,仅在第70天时对照杨树处理组蚓茧数显著高于转基因杨树组,其余7次调查均无显著差异;转基因杨树和对照杨树处理组蚓茧孵化率和每茧平均新生蚓数量无显著性差异;暴露140天,蚯蚓体内乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽过氧化物酶(GST)和超氧化物歧化酶(SOD)活性在转基因杨树和对照杨树处理组无显著性差异;通过ELISA法未在蚯蚓组织检测到外源Cry1A蛋白,说明长时间饲喂(140天)转基因杨树叶片,外源蛋白不会在蚯蚓体内蓄积。【结论】相对对照杨树,饲喂转基因杨树叶片对赤子爱胜蚓的生存、生长和繁殖无不利影响。