荧光定量PCR法检测不同状态下铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达

目的检测铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因(intⅠ1基因)在生物膜状态和浮游状态表达水平的差异,探讨整合子的作用机制。方法对3株Ⅰ类整合酶阳性的铜绿假单胞菌分别进行液相培养和生物膜细菌培养,常规方法提取3株细菌两种生长状态的总RNA。采用荧光定量PCR(FQ-PCR)法,以细菌的16srRNA为内参照,分别测定菌株SW07、R07和TH12的浮游细菌和生物膜细菌intⅠ1mRNA的相对表达量,比较3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达水平。结果3株铜绿假单菌的生物膜细菌和浮游细菌都检测到intⅠ1基因的表达。3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达量不同,生物膜细菌intⅠ1基因的表达水平较高,其中菌株R07、SW07和TH12的生物膜细菌intⅠ1mRNA的表达量分别较浮游细菌高1.4、5.7和128倍。结论在生物膜状态下,铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达上调,本实验结果提示整合子在生物膜细菌中可进行更加活跃的基因盒捕获和积累,整合子和细菌生物膜的形成是导致细菌对抗生素耐药的重要机制。

IntⅠ1基因突变致鲍曼不动杆菌耐药性丢失

目的探究鲍曼不动杆菌耐药性丢失与基因组序列的相关性。方法临床分离78株鲍曼不动杆菌,按CLSI进行药敏性实验,以PCR方法对IntⅠ1、ADC基因进行检测,并选择部分菌株进行测序分析。结果 78株鲍曼不动杆菌中,有1株完全不耐药,而相关基因PCR检测的阳性率均为100%。基因测序分析表明,在这株耐药性丢失的鲍曼不动杆菌中,IntⅠ1基因均发生3处DNA突变。结论 IntⅠ1基因对于鲍曼不动杆菌耐药性起着重要作用,相关位点突变将导致耐药性丢失。

苦参碱对多重耐药表皮葡萄球菌整合子intⅠ和dfrA的影响

为探索苦参碱对多重耐药表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis,SE)整合子整合酶(intⅠ)和二氢叶酸还原酶(dfrA)的影响,试验通过纸片扩散法筛选多重耐药菌株、以肉汤稀释法测定苦参碱对SE的最低抑菌浓度(MIC)和最佳逆转条件;通过普通PCR法测定苦参碱对SE整合子intⅠ和dfrA基因碱基序列的影响;通过荧光定量PCR法测定苦参碱对SE整合子intⅠ和dfrA mRNA表达量的影响,结果显示苦参碱亚浓度作用表皮葡萄球菌后对intⅠ、dfrA基因序列无影响;苦参碱对intⅠmRNA表达量具有抑制作用,而对dfrA mRNA表达量影响不大,结果表明在SE体内苦参碱可从mRNA水平上抑制SE intⅠ的表达量。

畜禽粪便堆放地土壤中抗生素抗性基因和细菌群落的垂直分布特征

本文通过对养殖场猪粪和鸡粪堆放地0~100 cm土壤样品的采集和分析,研究了长期堆放畜禽粪便对土壤中抗生素抗性基因(简称"抗性基因")和细菌群落结构垂直分布的影响。定量PCR结果表明,与对照土壤相比,猪粪和鸡粪堆放增加了0~100 cm土壤中四环素类抗性基因(tetC、tetG、tetL、tetW)、磺胺类抗性基因(sulI、sulII)以及整合酶基因(intI1)的检出率和检出丰度,说明粪肥堆放造成堆放地土壤中抗性基因污染。聚类分析结果表明,抗性基因和intI1基因的丰度随土壤深度呈递减趋势,且主要集中在0~30 cm土层,表明堆放地土壤中抗性基因存在向下层土壤迁移的风险。相关性分析表明, intI1基因分别与抗性基因呈显著正相关,说明intI1基因可能在抗性基因传播中起着重要作用。同时高通量测序结果表明,与对照土壤相比,猪粪和鸡粪堆放显著降低了0~10 cm和10~30 cm土层细菌群落结构的多样性, 0~30 cm土层中,猪粪和鸡粪堆放地土壤中细菌群落结构与对照土壤的差异要高于深层土壤。此外,方差分解分析结果表明,土壤化学性质和细菌群落结构均影响了土壤中抗性基因的垂直分布,且细菌群落结构的变化是其主要的影响因素。本研究可为控制畜禽粪便堆放地土壤中抗性基因污染提供科学依据。

不同构型人工湿地基质中土著菌的耐药性及整合子丰度调查

采用Kirby-Bauer纸片琼脂扩散法分析了夏、冬季节9个不同构型人工湿地中的葡萄球菌(Staphylococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)两种土著菌对7种常用抗生素的耐药性,并通过荧光定量PCR检测人工湿地基质中Ⅰ型整合子(int1)的丰度.结果表明,共分离出的522株葡萄球菌和543株假单胞菌,约84%的菌株对所测试的抗生素具有耐药性,多重耐药率达到68%以上,MRI指数平均为0.22,与某些环境中人源或动物源细菌耐药水平相当,表明人工湿地基质土著菌具有较高水平的耐药性;两种土著菌对氨苄西林和复方新诺明的耐药率较高,四环素、庆大霉素和环丙沙星的耐药率均极低(<3%),而对头孢他啶和氯霉素的耐药性呈现差别.湿地基质中int1基因的浓度为1.14×105~5.66×105copies·g-1,其相对丰度为0.54%~3.68%.季节和湿地工艺对细菌耐药和整合酶基因分布有较大影响.夏季2种细菌的抗生素耐药率、多重耐药指数和int1丰度均显著高于冬季;下行垂直流湿地中的抗生素耐药率、多重耐药指数(MRI)最高,而在水平潜流湿地中int1丰度最高.研究表明人工湿地基质的土著菌长期暴露在一定浓度抗生素和耐药肠道菌的生活污水环境下获得了耐药性,人工湿地中抗生素耐药菌和耐药基因的污染及环境风险不容忽视.