碱性蛋白酶基因在Bacillus licheniformis 2709中的整合和扩增

将含有去掉启动子的枯草杆菌碱性蛋白酶基因和Ｃｍ抗性基因的整合质粒ｐＭＰ以原生质体ＰＥＧ法转化Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ２７０９，在１０ｕ／ｍｌＣｍ平板上筛选整合子，并通过不断提高整合子的抗氯霉素能力来扩增染色体碱性蛋白酶基因，最终选到一株产酶比生产菌２７０９提高６０％的高表达整合菌ＢＬ－２０３，该菌在无选择压力下遗传性状相当稳定。

解淀粉芽胞杆菌不同整合位点对外源碱性蛋白酶表达的影响

为探究基因组上不同整合位点对外源碱性蛋白酶表达的影响,基于解淀粉芽胞杆菌TCCC 111018基因组信息,通过预测基因组上复制起始位点OriC确定了yaah基因整合位点;与此同时,通过分析6个胞外蛋白酶基因(epr、vpr、mpr、apr、bpr和nprE)单独缺失后对外源碱性蛋白酶酶活力的影响,并对发酵上清液中主要分泌蛋白的分析和质谱鉴定,确定了nprE和amyE基因位置为另外两个整合位点。在确定的3个整合位点处分别整合克劳氏芽胞杆菌来源的碱性蛋白酶基因aprE,并对整合菌株的碱性蛋白酶酶活力进行对比分析,结果表明整合菌株解淀粉芽胞杆菌18-ΔY∷aprE和18-ΔN∷aprE碱性蛋白酶酶活力分别达到784.36 U/mL和1289.09 U/mL,分别比原始菌株提高了15%和88.9%,实时荧光定量PCR和SDS-PAGE凝胶电泳表明18-ΔN∷aprE的碱性蛋白酶的转录水平和表达量均最高,这表明在nprE基因位点整合碱性蛋白酶基因可以有效提高碱性蛋白酶表达量,为进一步构建工业酶生产菌株奠定了基础。

耐热碱性蛋白酶AH-101的异源表达、酶学性质与洗涤应用研究

目的:通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库筛选可以应用于洗涤工业的蛋白酶,使用地衣芽孢杆菌进行高效表达。方法:利用同源重组的方式将蛋白酶基因整合到地衣芽孢杆菌基因组中,研究重组蛋白酶的酶学特性和洗涤效果。结果:该重组酶的最适作用温度为60℃,最适pH为11.0;AH-101具有良好的耐热性,可以在20~55℃范围内保持稳定,在60℃保温1 h,剩余活性仍高于30%;此外,该酶与表面活性剂和液体洗涤剂具有良好的兼容性,在终浓度为0.1%和0.5%的表面活性剂和液体洗涤剂中孵育2 h,重组酶的酶活力损失小于30%。结论:成功构建了一株含有外源蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株,对重组蛋白酶的特性和洗涤效果进行研究,该重组蛋白酶可以作为环保型酶制剂应用到洗涤工业中。