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Reconstruction of HP Intein with Overlap-extension PCR 被引量:1
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作者 李佳 林瑛 +3 位作者 张秀丽 扬子江 贾秋品 孟清 《Agricultural Science & Technology》 CAS 2012年第4期727-730,共4页
[Objective] This study aimed to reconstruct the HP intein by overlap-exten- sion PCR. [Method] Several primers were designed according to the principle of overlap-extension PCR that the repeat sequences were overlappe... [Objective] This study aimed to reconstruct the HP intein by overlap-exten- sion PCR. [Method] Several primers were designed according to the principle of overlap-extension PCR that the repeat sequences were overlapped and served as the template to the other DNA strand in amplification. Then, several rounds of over- lap PCR reaction were conducted to mutate the four cysteines in the HP intein into serines, and introduce a linker sequence containing a tag for product detection and purification. [Result] DNA sequencing analysis proved that the four cysteines in the HP intein were successfully mutated into serines; the PCR precursor fragments were also rejoined into an intact HP gene fragment, without introducing any other unex- pected mutation; the DNA linker of 46 bp was successfully inserted into the de- signed HP gene sequences, without any mutation and base pair mismatch. [Conclu- sion] The HP intein was rapidly reconstructed by overlap-extension PCR in this study, which not only expands the application of overlap PCR in protein engineering, but also provides a simple, efficient and highly accurate tool for the reconstruction and modification of intein. 展开更多
关键词 Overlap-extension PCR Reconstruction of intein Primer design Application of intein
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Intein介导的重组昆虫毒素BmKIT在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及活性分析 被引量:4
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作者 许成钢 范晓军 +2 位作者 张志云 付月君 梁爱华 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期989-994,共6页
为获得重组蝎昆虫毒素BmKIT,通过PCR方法在BmKIT基因的3′端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽Ssp DnaB Intein基因下游的多克隆位点(MCS)。将获得的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱... 为获得重组蝎昆虫毒素BmKIT,通过PCR方法在BmKIT基因的3′端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽Ssp DnaB Intein基因下游的多克隆位点(MCS)。将获得的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导融合蛋白表达。用Ni-NTA亲和层析柱从菌体裂解液中纯化了CBD-Intein-BmK IThis6融合蛋白,并在柱上诱导Intein自剪切,成功去除融合子CBD-Intein。通过Superdex75凝胶过滤层析获得了纯度达95%以上的BmK IThis6蛋白,该蛋白不仅具有正确的二级结构而且有生物活性。 展开更多
关键词 东亚钳蝎昆虫毒素 原核表达 intein自剪切 虫试实验
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DnaB Split Intein高表达载体及其介导的环肽库构建
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作者 蔺增曦 王胜兰 +1 位作者 杨秀山 杨克迁 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1924-1930,共7页
以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的... 以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒。将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的剪接反应,生成环化的DnaB-N蛋白。将合成的包含随机编码5肽的大小为115 bp的片段插入质粒pEV DnaB-N位置,转化大肠杆菌后得到一个编码含有6肽(含5个随机氨基酸和1个Cys)的包含约103个克隆的表达载体pEV-IS库。随机挑取20个克隆,测序证明均按正确阅读框插入了不同的小肽序列;挑取其中9个克隆进行表达,结果表明可产生大量的融合蛋白,90%的融合蛋白在16oC表达20 h后发生体内剪接。将在30oC表达3 h的融合蛋白用His柱进行纯化,通过MALDI-TOF质谱检测到了目的环肽分子量。 展开更多
关键词 SPLIT SSP DNAB mini—intein 环肽库 自我剪接
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双Intein介导3片段vWF的反式剪接 被引量:3
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作者 朱甫祥 郭猛 +2 位作者 刘泽隆 屈慧鸽 迟晓艳 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期157-163,共7页
von Willebrand因子(vWF)基因突变导致血管性血友病(VWD),由于其基因过大在基因治疗研究中难以为多数病毒载体携带.利用双内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能研究断裂成3段的vWF基因分别表达后在蛋白水平的连接,旨在为vWF基因的3载体... von Willebrand因子(vWF)基因突变导致血管性血友病(VWD),由于其基因过大在基因治疗研究中难以为多数病毒载体携带.利用双内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能研究断裂成3段的vWF基因分别表达后在蛋白水平的连接,旨在为vWF基因的3载体联合转移应用于VWD基因治疗研究提供依据.将vWF cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段(N、M和C),分别与splitSspDnaE intein的N端(En)、C端(Ec)和splitSspDnaB intein的N端(Bn)、C端(Bc)编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)中的His-Tag的下游,得到3种表达载体pET-NEn、pET-EcMBn和pET-BcC.分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE分析融合蛋白的表达,并进一步用His-Tag的特异性抗体进行分析;亲和层析纯化分别表达的带His-Tag标签的3段蛋白,复性后体外混合进行剪接实验以观察3片段vWF的连接.结果显示,3段预期大小的融合intein的vWF蛋白均有表达,用His-Tag抗体进行的Western印迹得到进一步证实;3段纯化的蛋白混合后可见明显的剪接条带形成,与vWF的预期分子量大小一致,表明双intein通过蛋白质反式剪接可有效连接3个片段的vWF,为进一步应用蛋白质剪接技术的3重载体真核细胞转vWF基因奠定了基础. 展开更多
关键词 内含肽 蛋白质反式剪接 von WILLEBRAND因子
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Inteins--A Focus on the Biotechnological Applications of Splicing-Promoting Proteins
5
作者 Manfredi Miraula Charmaine Enculescu +1 位作者 Gerhard Schenk Natasa Mitic 《American Journal of Molecular Biology》 2015年第2期42-56,共15页
The main aim of this mini-review is to illustrate strategies and industrial applications based on inteins (INTErnal proteINS), which belong to a class of autocatalytic enzymes that are able to perform a catalytic reac... The main aim of this mini-review is to illustrate strategies and industrial applications based on inteins (INTErnal proteINS), which belong to a class of autocatalytic enzymes that are able to perform a catalytic reaction on a single substrate. However, since practical applications of inteins are strongly guided by a detailed understanding of their biological mechanisms and functions, the first part of this review will thus briefly discuss the physiological roles of inteins, describing what is currently known about their mechanisms of action. In the second part, specific biotechnological applications of inteins will be outlined (i.e. their use for (i) the purification of recombinant proteins, (ii) the cyclization of proteins and (iii) the production of seleno-proteins), paying attention to both potential strengths and weaknesses of this technology. 展开更多
关键词 intein Protein Purification Tagged Protein CYCLIZATION SELENOPROTEIN
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钯配合物对结核杆菌RecA intein蛋白质剪接的抑制作用
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作者 刘嬿 吴芩 +1 位作者 郑玉船 刘扬中 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2013年第2期272-276,共5页
研究了5种钯配合物Pd(bipy)Cl2,Pd(phen)Cl2,[Pd(dien)Cl]Cl,trans-Pd(NH3)2Cl2和cis-Pd(NH3)2 Cl2对结核杆菌RecA intein蛋白质剪接的抑制作用.结果表明,trans-Pd(NH3)2 Cl2的抑制活性最好,IC50=3.3×10-5 mol/L.钯配合物通过与int... 研究了5种钯配合物Pd(bipy)Cl2,Pd(phen)Cl2,[Pd(dien)Cl]Cl,trans-Pd(NH3)2Cl2和cis-Pd(NH3)2 Cl2对结核杆菌RecA intein蛋白质剪接的抑制作用.结果表明,trans-Pd(NH3)2 Cl2的抑制活性最好,IC50=3.3×10-5 mol/L.钯配合物通过与intein的第一个氨基酸(半胱氨酸)配位,从而抑制蛋白质的剪接活性.荧光猝灭的动力学数据表明,配体的大小会明显影响钯配合物与intein的相互作用,配体越大,作用越慢. 展开更多
关键词 蛋白质内含子 蛋白质剪接 钯配合物
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Split Inteins介导的多肽链两端标记
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作者 张晓玲 戴旭东 +1 位作者 林瑛 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期535-542,共8页
多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面.但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求.本文以Diub(ub... 多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面.但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求.本文以Diub(ubiquitin dimer)蛋白为研究对象,借助S1和S11型2种不同的断裂蛋白质内含子(split inteins)的蛋白质反式剪接,将含有不同荧光基团的两种小肽成功剪接至靶蛋白的两端,最终达到对靶蛋白的末端标记目的. 展开更多
关键词 断裂蛋白质内含子 蛋白质反式剪接 N端和C端标记 荧光基团
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异源生物中筛选高剪接活性Intein系统的建立
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作者 周倩 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期282-286,共5页
原始物种体内蛋白质内含子(intein)介导的自催化蛋白剪接反应以100%效率进行.当这些蛋白质内含子被克隆入异源物种时,其剪接效率往往大大降低,绝大多数甚至完全失去剪接能力.本研究根据蛋白质内含子剪接活性与蛋白质外显子(extein)C端第... 原始物种体内蛋白质内含子(intein)介导的自催化蛋白剪接反应以100%效率进行.当这些蛋白质内含子被克隆入异源物种时,其剪接效率往往大大降低,绝大多数甚至完全失去剪接能力.本研究根据蛋白质内含子剪接活性与蛋白质外显子(extein)C端第1个保守氨基酸直接相关的特点,设计含有所有这些保守氨基酸的多个短的蛋白质外显子序列,通过PCR引入到卡那霉素抗性蛋白(KanR)的不同位点中,在此外显子中克隆入相应的蛋白质内含子,构建在大肠杆菌中依赖卡那霉素抗性来筛选高剪接活性蛋白质内含子的系统.结果显示,卡那霉素平板上菌落生长的结果与Western印迹检测的结果基本一致.说明建立的筛选高剪接活性蛋白质内含子系统成功.这种含有可选择蛋白质外显子的筛选系统,将蛋白质剪接与卡那霉素抗性相结合,直接从平板上观测剪接结果,成为快速、稳定筛选在异源物种中具有剪接活性蛋白内含子的新手段. 展开更多
关键词 蛋白质内含子 蛋白质外显子 卡那霉素抗性 蛋白质剪接
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Anti-metastatic Effect of Repeated Cyclic-GRGDSPA Peptide Produced by Intein Protein Trans-splicing on Murine B16 Melanoma Cells 被引量:1
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作者 Fuxiang ZHU Zelong LIU +1 位作者 Xiaoyan CHI Xianqing LIU 《中国肺癌杂志》 CAS 2009年第6期665-667,共3页
Background and objective Metastasis is one of the most important causes of mortality in tumor. The pathological process of metastasis includes several sequential steps as
关键词 肺癌 治疗 临床 药物
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卡纳抗性结核杆菌RecA intein蛋白剪接抑制剂筛选系统
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作者 胡静平 姜羽婷 齐兴梅 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期101-103,共3页
结核分枝杆菌中的3个蛋白分别受intein调控,必须经过翻译后的蛋白剪接将intein去除才能成为有活性的蛋白,并且它们对结核杆菌的生长繁殖非常重要。这表明intein可以作为抗结核药物的一个新的作用靶点。因此,建立一个蛋白剪接抑制剂的高... 结核分枝杆菌中的3个蛋白分别受intein调控,必须经过翻译后的蛋白剪接将intein去除才能成为有活性的蛋白,并且它们对结核杆菌的生长繁殖非常重要。这表明intein可以作为抗结核药物的一个新的作用靶点。因此,建立一个蛋白剪接抑制剂的高通量筛选系统对于大规模筛选抗结核新药尤为重要。将结核杆菌的RecA intein插入卡那霉素抗性蛋白基因中破坏其卡那霉素抗性,再通过intein剪接将其恢复。利用卡那霉素的LB平板筛选和Western Blot验证,结果表明依赖卡那霉素抗性的筛选系统可以精确地反映intein的剪接效率,因此可以作为intein剪接抑制剂的筛选系统。为了验证该系统的可行性,在含有卡那霉素的液体LB培养基中加入对intein剪接有抑制作用的顺铂,结果表明大肠杆菌的生长受到严重影响,从而直接反映顺铂对intein的剪接抑制作用。 展开更多
关键词 结核杆菌 蛋白质内含子 蛋白质剪接 卡那霉素抗性
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Intein融合表达鸡IL-2蛋白的多克隆抗体制备 被引量:4
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作者 邓晨 郑海南 +5 位作者 于佩峰 张鑫 吴山力 王梦云 吕岩 艾永兴 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期889-894,共6页
鸡白介素-2(chIL-2)是一种对T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞复制与分化起重要作用的细胞因子,并在机体天然免疫和获得性免疫的发生与维持中发挥重要作用。本研究中,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366bp)克隆连接到pTYB1原核表... 鸡白介素-2(chIL-2)是一种对T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞复制与分化起重要作用的细胞因子,并在机体天然免疫和获得性免疫的发生与维持中发挥重要作用。本研究中,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366bp)克隆连接到pTYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362bp的Intein基因融合在同一开放阅读框内,编码相对分子质量约为71 000的chIL-2-Intein融合蛋白。诱导表达chIL-2-intein融合蛋白,应用chitin-sepharose亲和层析进行融合蛋白纯化。用纯化的chIL-2-intein融合蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体。应用昆虫细胞表达系统纯化出的chIL-2-6His蛋白作为抗原,包被ELISA板用于抗体效价的检测,Western blot分析抗体特异性。结果,应用纯化的chIL-2-intein融合蛋白成功制备特异性chIL-2抗体,效价高达4 096 000,且该抗体也能用于Intein标签蛋白的检测。 展开更多
关键词 intein CHICKEN IL-2 pTYB1 多克隆抗体
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vWF促进intein剪接的BDD-FVⅢ的分泌和活性 被引量:3
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作者 朱甫祥 杨树德 +3 位作者 刘泽隆 缪静 屈慧鸽 迟晓艳 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期595-600,共6页
vWF是由巨核细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白,其主要功能之一为凝血VIII因子(FVIII)的载体,防止后者被血浆酶降解。作者最近的工作证明intein可应用于双载体转移B结构域缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,通过翻译后的蛋白质反式剪接形成完整... vWF是由巨核细胞和血管内皮细胞合成的糖蛋白,其主要功能之一为凝血VIII因子(FVIII)的载体,防止后者被血浆酶降解。作者最近的工作证明intein可应用于双载体转移B结构域缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,通过翻译后的蛋白质反式剪接形成完整的功能性BDD-FVIII蛋白。为了研究vWF对于intein连接的BDD-FVIII分泌和活性的影响,通过intein融合的BDD-FVIII重、轻链基因和vWF基因共转染培养的293细胞,采用ELISA观察了分泌至培养上清液中的由intein剪接的全长BDD-FVIII抗原量,并用Coatest检测了由其产生的活性。结果显示,vWF基因共转染细胞上清液中,全长BDD-FVIII抗原量为(235±21)ng·mL-1,活性为(1.98±0.2)u·mL-1,明显高于未转染vWF的细胞[(110±18)ng·mL-1和(1.10±0.15)u·mL-1],也明显高于单独转染BDD-FVIII基因的对照细胞[(131±25)ng·mL-1和(1.22±0.18)u·mL-1],表明vWF基因共转染可显著改善双载体转BDD-FVIII基因后intein剪接的BDD-FVIII蛋白的分泌和生物活性。为基于蛋白质剪接的断裂BDD-FVIII基因转移的甲型血友病基因治疗研究中,应用vWF基因共转移以提高治疗的功效提供了依据。 展开更多
关键词 von WILLEBRAND因子 凝血VIII因子 共转染 分泌 intein 蛋白质反式剪接作用
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Ssp DnaB intein大肠杆菌中介导FVIII重链和轻链的连接 被引量:7
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作者 朱甫祥 刘泽隆 +3 位作者 屈慧鸽 辛晓林 董洪新 刘相钦 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期1101-1106,共6页
研究利用intein的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对凝血VIII因子(FVIII)重链和轻链的连接作用,将B结构域大部分缺失型FVIII(BDD-FVIII)于满足剪接所需的保守性氨基酸Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与split mini Ssp DnaB intein的106... 研究利用intein的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对凝血VIII因子(FVIII)重链和轻链的连接作用,将B结构域大部分缺失型FVIII(BDD-FVIII)于满足剪接所需的保守性氨基酸Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与split mini Ssp DnaB intein的106个氨基酸的N端(Int-N)和48个氨基酸的C端(Int-C)融合,构建到原核表达载体pBV220。诱导表达后SDS-PAGE分析可见预期大小的BDD-FVIII蛋白条带,Western blotting用FVIII特异性抗体证明其为剪接所产生的BDD-FVIII蛋白,表明intein可有效连接BDD-FVIII的重链和轻链。为进一步甲型血友病基因治疗研究应用intein以双腺相关病毒载体(AAV)携带FVIII基因,克服单个AAV载体的容量限制提供了依据。 展开更多
关键词 intein.蛋白质反式剪接 凝血Ⅷ因子
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引入糖基化位点和L303E/F309S突变促进intein介导的断裂凝血Ⅷ因子剪接 被引量:1
14
作者 朱甫祥 刘泽隆 +2 位作者 缪静 屈慧鸽 迟晓艳 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期1361-1366,共6页
作者最近证明intein的蛋白质剪接技术可用于双载体转B区缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,在此基础上,本研究将具有促FVIII分泌作用的L303E/F309S双突变和B结构域糖基化位点引入BDD-FVIII重链,观察重链变体对intein剪接的BDD-FVIII蛋白分泌... 作者最近证明intein的蛋白质剪接技术可用于双载体转B区缺失型FVIII(BDD-FVIII)基因,在此基础上,本研究将具有促FVIII分泌作用的L303E/F309S双突变和B结构域糖基化位点引入BDD-FVIII重链,观察重链变体对intein剪接的BDD-FVIII蛋白分泌和活性的影响。用分别融合Ssp DnaB intein的重链变体(DMN6HCIntN)和轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA分析分泌至培养上清液中的剪接BDD-FVIII蛋白量,并用发色法检测培养上清液的凝血生物活性。结果显示,DMN6HCIntN和IntCLC共转基因细胞上清液中剪接BDD-FVIII的浓度为(149±23)ng.mL-1,活性为(1.12±0.14)u.mL-1,明显高于intein融合的野生型重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)共转基因细胞[(99±14)ng.mL?1和(0.77±0.13)u.mL?1],提示重链变体能明显促进剪接BDD-FVIII蛋白的分泌和活性;另外,还检测到不依赖细胞机制的BDD-FVIII剪接。本研究为进一步动物体内双AAV载体转BDD-FVIII基因研究提供了依据。 展开更多
关键词 凝血VIII因子 重链变体 分泌 intein 蛋白质剪接
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荧光假单胞菌G2-EPSP合酶的拆分和intein介导的活性恢复 被引量:1
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作者 顿宝庆 陆伟 +11 位作者 张维 平淑珍 王旭静 陈明 徐玉泉 金丹 王劲 赵仲麟 梁爱敏 侯松娜 Ming-Qun Xu 林敏 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1479-1481,共3页
利用GPS-LS接点扫描系统,在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp(即编码5个氨基酸短肽)的外源片段,建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库.利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER279... 利用GPS-LS接点扫描系统,在荧光假单胞菌G2的5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶编码基因aroA中随机插入15 bp(即编码5个氨基酸短肽)的外源片段,建立含一系列不同插入位点的aroA突变体库.利用内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799对突变体库进行功能互补筛选,测序后确定了12个可以忍受5个氨基酸插入的位点,其中位点F295/T296经Ssp DnaE内含肽(intein)介导的蛋白互补技术鉴定为可拆分和蛋白重建的位点.从位点F295/T296将G2-EPSPS基因一分而二,N-端和C-端片段分别连接在携带Ssp DnaE内含子元件的原核表达双质粒上,获得共转化质粒pMEPSN295IN和pKEPSc296Ic.将质粒pMEPSN295IN和pKEPSc296Ic分别或共转化内源aroA基因缺失的大肠杆菌突变株ER2799中,携带共转化质粒的重组子能够在M9限制性培养基生长,而携带单一质粒的不能生长,表明从位点F295/T296拆分的aroA基因在内含肽介导下实现了蛋白重建,在突变株ER2799中恢复了5-磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性,酶活水平达到野生型的62.92%,为4.48 U/mg. 展开更多
关键词 基因拆分 内含肽(intein) 蛋白重建 转基因
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大肠杆菌BL21(DE3)中DnaE intein介导ABCA1蛋白的连接
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作者 朱甫祥 缪静 +1 位作者 屈慧鸽 迟晓艳 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1601-1606,共6页
【目的】利用SspDnaEintein的蛋白质反式剪接技术研究在大肠杆菌中对ABCA1基因表达产物的连接作用。【方法】将ABCA1的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys978密码子前断裂为N端和C端两部分,分别与天然存在的反式作用SspDnaEintein的12... 【目的】利用SspDnaEintein的蛋白质反式剪接技术研究在大肠杆菌中对ABCA1基因表达产物的连接作用。【方法】将ABCA1的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys978密码子前断裂为N端和C端两部分,分别与天然存在的反式作用SspDnaEintein的123个氨基酸的N端和36个氨基酸的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)。转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,诱导表达后观察重组蛋白的表达和ABCA1的连接。【结果】转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示预期大小的ABCA1剪接蛋白条带,并进一步为His-Tag抗体进行的Western blotting证实。【结论】结果表明SspDnaEintein可有效催化ABCA1的连接,为进一步研究利用双腺相关病毒(AAV)载体转运ABCA1基因,克服单个AAV载体容量限制进行由ABCA1基因突变所致Tangier病的基因治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 DnaE intein 蛋白质反式剪接 ABCA1 连接
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应用Intein融合的鸡IL-2蛋白制备多克隆抗体 被引量:3
17
作者 邓晨 于佩峰 +3 位作者 张鑫 王梦云 吕岩 艾永兴 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期368-374,共7页
研究Intein标签与目的蛋白chIL-2融合作为抗原,进行高效价兔抗chIL-2蛋白多克隆抗体的制备,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366 bp)克隆连接到p TYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362 bp的Intein基因融合在同1开放阅读框内,编码分... 研究Intein标签与目的蛋白chIL-2融合作为抗原,进行高效价兔抗chIL-2蛋白多克隆抗体的制备,将去除去了N-端信号肽的chIL-2基因(366 bp)克隆连接到p TYB1原核表达载体,将chIL-2基因与1 362 bp的Intein基因融合在同1开放阅读框内,编码分子量约为71 ku的chIL-2-Intein融合蛋白。诱导表达chIL-2-Intein融合蛋白,应用Chitin-Sepharose亲和层析进行融合蛋白纯化。用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白免疫大白兔制备多克隆抗体。应用昆虫细胞表达系统纯化出的chIL-2-6His蛋白作为抗原,包被ELISA板用于抗体效价的检测,Western Blot分析抗体特异性。结果表明:应用纯化的chIL-2-Intein融合蛋白成功制备特异性chIL-2抗体,效价高达4 096 000,且该抗体也能用于Intein标签蛋白的检测。 展开更多
关键词 内肽酶 鸡白介素-2 pTYB1 多克隆抗体
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无融合标签的蜂毒肽在大肠杆菌中的表达纯化和抑菌研究
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作者 彭鑫怡 席志文 +1 位作者 张荣珍 徐岩 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期47-55,共9页
蜂毒肽(Melittin,MET)是一种具有抗炎和抗肿瘤作用的小分子活性肽,其可溶性表达和无融合标签活性肽的纯化一直是个难题。基于类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)的相变特性和内含肽(Intein)的自裂解特性,构建重组表达菌株Escheri... 蜂毒肽(Melittin,MET)是一种具有抗炎和抗肿瘤作用的小分子活性肽,其可溶性表达和无融合标签活性肽的纯化一直是个难题。基于类弹性蛋白(Elastin-like polypeptide,ELP)的相变特性和内含肽(Intein)的自裂解特性,构建重组表达菌株Escherichia coli/pET21a-ELP-Intein-MET,在E.coli BL21(DE3)宿主细胞中实现融合蛋白的可溶性表达。重组菌破碎上清液经过温度诱导的可逆相变循环纯化以及融合蛋白自裂解的pH、温度和时间优化,在pH 7.0、30℃的条件下自裂解32 h,再经过凝胶层析纯化,得到了纯度高于95%的无融合标签的蜂毒肽。纯化后的蜂毒肽用于Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis 168和Escherichia coli JM109的抑菌研究,发现其对革兰氏阳性菌的抑制作用强于革兰氏阴性菌,蜂毒肽在3种菌中的最小抑菌质量浓度分别为12.5、50.0、100.0μg/mL。作者通过引入弹性蛋白和内含肽,不仅实现了蜂毒肽的高效可溶性表达,且通过较简便的蛋白质分离纯化获得无融合标签的蜂毒肽,该纯化活性肽的抑菌功能与商品化的蜂毒肽相似,有望为蜂毒肽的工业化制备提供新的思路。 展开更多
关键词 蜂毒肽 ELP标签 内含肽 抑菌活性
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Intein介导的重组人AR DBD的原核可溶性表达、纯化及活性鉴定 被引量:2
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作者 姚广新 张怡轩 胡双纲 《中国生物工程杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期7-11,共5页
雄激素受体通过DNA结合域与效应元件结合发挥作用,在以往的研究中多采用与GST或Protein A融合的方式对雄激素受体的DNA结合域(AR DBD)进行重组表达,但获得无融合标签的纯AR DBD的操作非常繁琐。现借助内含肽介导的自剪切作用经一步亲和... 雄激素受体通过DNA结合域与效应元件结合发挥作用,在以往的研究中多采用与GST或Protein A融合的方式对雄激素受体的DNA结合域(AR DBD)进行重组表达,但获得无融合标签的纯AR DBD的操作非常繁琐。现借助内含肽介导的自剪切作用经一步亲和层析得到纯度较高的无融合标签的AR DBD,以利于对其性质和功能的研究。通过PCR方法扩增了编码人雄激素受体520~644位氨基酸的核苷酸序列,将该序列克隆入pTWIN1融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后对诱导温度及IPTG浓度进行优化,重组蛋白几乎全部可溶表达。将可溶性部分吸附到几丁质亲和层析柱上,通过pH诱导的内含肽自剪切作用释放出不含融合标签的重组人ARDBD蛋白,凝胶阻滞分析证明该蛋白只特异性结合保守的雄激素响应元件(ARE),具备正常的生物学活性。 展开更多
关键词 雄激素受体 DNA结合域 内含肽
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Analysis of the characteristic sequence of intein and revision of its motifs
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作者 Jun Xie Jingfei Huang +1 位作者 Xiufan Shi Ciquan Liu 《Chinese Science Bulletin》 SCIE EI CAS 2001年第9期758-761,共4页
Since the first intein (Sce VMA) was found in Saccharomydes cerevisiae ATPases gene in 1990, more and more inteins were identified. It is necessary to analyze the new inteins to understand the sequence charateristics ... Since the first intein (Sce VMA) was found in Saccharomydes cerevisiae ATPases gene in 1990, more and more inteins were identified. It is necessary to analyze the new inteins to understand the sequence charateristics of inteins. By searching protein and nucleic acid database systematically, 101 inteins were found, of which 69 inteins contain homing endonuclease motifs. We only analyze the 69 inteins since most inteins are the classic inteins with homing endonuclease motifs. We found that the distribution of these inteins is particular among species and protein. By multiple sequence alignment, some new sequence characteristics were found and the motifs described previously were revised. 展开更多
关键词 intein DISTRIBUTION LOCATION of intein SEQUENCE charateristics.
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