IPS-1基因缺失突变体对IFN-β诱生作用及抗HSV-1病毒作用的影响

目的：初步研究缺失300—444位氨基酸突变体△IPS-1对IFN-β诱生作用及抗HSV-1病毒作用的影响，进而确定该部位对IPS-1发挥正常功能的作用。方法：通过重叠延伸PCR法获得缺失300～444位氨基酸的△IPS-1，构建突变重组质粒pEF—BOS—FLAG—△IPS-1，并经酶切及测序鉴定。采用磷酸钙体外转染HEK293T真核细胞。经Western blot检测蛋白的表达；ELISA检测细胞上清中IFN—β分泌量；HSV-1病毒感染分别转染了pEF—BOS—FLAG／IPS-1、pEF—BOS—FLAG／△IPS-1质粒的HEK293T细胞，空斑检测各转染细胞组不同时间段细胞上清的病毒滴度。结果：成功构建了缺失300～444位氨基酸的IPS-1基因重组真核表达载体pEF—BOS—FLAG／△IPS-1；与转染pEF—BOS—FLAG／IPS-1质粒组相比转染了pEF—BOS—FLAG／△IPS-1的细胞在不同时间段其上清中IFN—β分泌量有一定量的减少；空斑测定结果表明转染了pEF—BOS—FLAG／△IPS-1质粒组细胞中病毒滴度明显高于pEF—BOS-FLAG／IPS-1质粒组。结论：△IPS-1与IPS-1相比能使HEK293T细胞IFN—β分泌量明显减少，△IPS-1不能完全抑制HSV-1感染细胞产生的细胞病变效应，该突变体抗HSV-1病毒作用有一定程度的减弱。

一种改进型基于荧光蛋白重定位系统的丙型肝炎病毒滴度检测方法的建立

目的建立一种简单、快速检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的荧光细胞系检测系统,并用其检测HCV滴度。方法通过RT-PCR法获得干扰素β启动刺激因子-1(interferon beta promoter stimulator-1,IPS-1)蛋白C-端第462-540位氨基酸(C462-540)的基因序列及含有SV40核定位信号的IPS-1(C462-540)基因序列,插入经同样酶切的慢病毒表达载体LV-CAG--EGFP-WPRE、LV-CAG—mCherry(RFP)-WPRE,构建表达EGFP-IPS-1(C462-540)、RFP-NLS-IPS-1(C462-540)的慢病毒重组表达质粒;在此基础上构建含有IPS-1(C462-540)-2A-EGFP-puro、IPS-1(C462-540)-IRES-EGFP-puro的慢病毒重组表达质粒;利用293T细胞包装含有IPS-1(C462-540)蛋白的重组慢病毒;感染Huh7.5细胞,流式细胞仪筛选稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的Huh7.5细胞,或用puromycin筛选稳定表达EGFP的Huh7.5细胞;利用10倍系列稀释的HCV感染上述细胞,检测HCV的滴度。结果测序表明4种慢病毒表达质粒构建正确;收获的慢病毒感染Huh7.5细胞48 h后,可见EGFP或RFP表达,经流式细胞仪分选获得了稳定表达EGFP-IPS-1(C462-540)、RFP-IPS-1(C462-540)的细胞系,经puromycin筛选获得了稳定表达EGFP-IPS-1(C462-540)的细胞系;经10倍系列稀释的HCV感染后,弥散在细胞质中的点状EGFP、RFP会扩散到整个细胞或定位到细胞核中,在甲基纤维素的限制下形成明显的荧光噬斑点,通过计算荧光噬斑点数得到用Huh7.5-EGFP-IPS-1(462-540)-IRES-PURO、Huh7.5两种细胞检测的HCV滴度分别为(5.6±0.2)×10~5和(5.5±0.2)×10~5 PFU/mL,二者无显著差异。结论成功构建了含有绿色荧光或红色荧光报告系统的细胞系,建立了一种简单、快速检测HCV滴度的新方法。