猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域基因的克隆表达及其多克隆抗体制备

为了克隆表达猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域(IFN2EC)基因,试验采用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中扩增出猪Ⅰ型干扰素受体Ⅱ胞外域基因的cDNA序列,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,并将阳性重组质粒转化BL21(DE3)菌株,IFN2EC重组蛋白得到高效表达.将融合蛋白IFNR2EC免疫BALB/C小鼠,获得鼠抗IFN2EC融合蛋白多克隆抗体,将得到的融合蛋白多克隆抗体采用间接ELISA和Western-blotting试验方法检测.本研究成功构建重组表达质粒pET-IFNR2EC,ELISA测定多克隆抗体的效价为1∶12800,Western-blotting试验结果表明,制备的鼠抗IFNR2EC融合蛋白多克隆抗体可以与融合蛋白进行特异性结合,从而证明融合蛋白具有很好的免疫原性.

鸡干扰素α受体Ⅱ胞外域的克隆及GST融合蛋白原核表达

应用RT-PCR技术扩增鸡干扰素α受体Ⅱ胞外域(CHIFNAR2 EC)基因片段,将扩增产物克隆至pMD-18T,转化J M109感受态。重组质粒与表达载体pGEX-6P-1经双酶切后构建重组表达质粒pGEX-6P-CHIF-NAR2EC,转入BL21,提取质粒酶切和测序鉴定。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99%。用IPTG诱导表达,对诱导条件进行初步优化,表达蛋白主要以包涵体的形式存在。通过切胶的方法进行纯化,获取具有较高纯度的融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示融合蛋白分子量大小约为50 KD,采用抗GST抗体进行Western Blot,成功检测到特异性目的条带。

IFN-γ和IL-4对乳腺癌细胞MCF-7生长及雌激素受体亚型影响的观察

目的:探讨干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长特性及雌激素受体(ER)亚型表达的影响。方法:以不同浓度IFN-γ(50、100和150μg/L)或IL-4(5、10和25μg/L)分别作用MCF-7细胞24、48、72和96h,MTT法检测细胞的增殖水平。选择100μg/L IFN-γ或10μg/L IL-4作用细胞96h(M/IFN-γ或M/IL-4),蛋白质印迹法检测ERα和ERβ的蛋白表达,流式细胞术分析细胞周期,RT-PCR检测凋亡抑制基因mRNA表达。结果:与对照组相比,IFN-γ作用96h后,细胞增殖活性受到抑制(100μg/L组P=0.000,150μg/L组P=0.003),G0～G1期细胞比例增多(P=0.003),S期减少(P=0.005),ERβ蛋白表达水平增加,P=0.038。IL-4作用96h后,细胞增殖活性增强(10μg/L组P=0.006,25μg/L组P=0.002),G0～G1期细胞比例减少(P=0.008),S期增多(P=0.007),ERβ蛋白表达水平减少(P=0.021),凋亡抑制基因的表达水平增加,P值分别为0.002、0.000和0.004。结论:辅助性T淋巴细胞1型(Th1)类细胞因子IFN-γ和Th2类细胞因子IL-4可分别促进或抑制ERβ表达,进而抑制或促进肿瘤细胞生长;Th1/Th2偏移对乳腺癌细胞生长特性的作用,可能与改变ER亚型表达比例有关。