重组猪IL-2对口蹄疫重组腺病毒免疫增强效果的研究

目的构建表达猪白细胞介素-2(poIL-2)的重组腺病毒,研究其作为佐剂对口蹄疫重组腺病毒免疫效果的影响。方法将poIL-2基因克隆到腺病毒的穿梭载体中,与腺病毒骨架载体共转化BJ5183感受态细胞,获得的重组病毒质粒通过脂质体转染HEK-293A细胞,获得表达poIL-2的重组腺病毒(rAd5poIL-2)。以rAd5poIL-2作为佐剂与表达PMDV VP基因的重组腺病毒(rAd5VP1)联合免疫小鼠,以单独免疫rAd5VP1的小鼠作为对照。通过测定淋巴细胞增殖指数、特异性抗体、IL-4和IFN-γ的水平来衡量rAd5poIL-2对rAd5VP1的免疫增强效果。结果经PCR鉴定,成功构建了rAd5poIL-2。MTT与抗体检测结果显示,rAd5poIL-2既能增强rAd5VP1诱导小鼠淋巴细胞增殖,又能促进rAd5VP1诱导小鼠特异性抗体的产生,细胞因子检测结果显示,rAd5poIL-2能促进rAd5VP1诱导Th1和Th2的分化。结论 rAd5poIL-2可望成为口蹄疫疫苗的候选佐剂。

共表达口蹄疫病毒VP1-2A基因与猪IL-2重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

构建共表达口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因和猪白细胞介素2(IL-2)基因的重组腺病毒,并研究重组病毒对小鼠特异性免疫的影响。将FMDV VP1-2A基因和猪IL-2基因先后克隆到腺病毒的穿梭载体pAdenoVator-CMV5-IRES-GFP中,在受体菌中与腺病毒骨架载体pAdenoVatorΔE1/E3同源重组。重组腺病毒质粒转染HEK-293A细胞,得到重组腺病毒rAd5VP1-2A-Po IL-2。MTT法检测重组IL-2的生物活性。用rAd5VP1-2A-poIL-2免疫接种小鼠,同时设免疫单独表达FMDV VP1基因的重组腺病毒rAd5VP1和空腺病毒的对照组。通过检测淋巴细胞增殖功能,特异性抗体分泌,IL-4和IFN-γ的表达水平衡量rAd5VP1-2A-poIL-2对小鼠特异性免疫应答的影响。结果显示,成功获得了rAd5VP1-2A-poIL-2,MTT法检测重组IL-2具有生物学活性。小鼠免疫试验结果显示,与rAd5VP1免疫组相比,rAd5VP1-2ApoIL-2免疫既能增强重组病毒诱导小鼠淋巴细胞增殖的能力,又能提高重组病毒诱导小鼠特异性抗体的水平。细胞因子检测结果显示,串联IL-2能促进重组病毒诱导Th1和Th2的分化。研究结果说明,rAd5VP1-2A-poIL-2可望成为口蹄疫的候选疫苗。

重组白介素-2增强口蹄疫病毒多表位疫苗免疫效果研究

通过研究重组白细胞介素-2(IL-2)对口蹄疫病毒(FMDV)多表位疫苗免疫效果的增强作用,为IL-2作为FMDV表位疫苗佐剂应用提供实验依据。6周龄雌性Balb/c小鼠,分为4组,第1组联合免疫表达猪IL-2的重组腺病毒(rAd5poIL-2)和串联表达FMDV多表位基因的重组腺病毒(rAd5EGS),第2、3和4组分别注射rAd5EGS、灭活疫苗和PBS,间隔2周免疫1次,共免疫3次。首免后每周采血分离小鼠血清,通过ELISA检测血清中特异性IgG;首免后6周检测血清中抗体亚型IgG1、IgG2a及细胞因子IL-4和IFN-γ的表达水平,同时分离脾细胞,MTT法检测淋巴细胞增殖指数。结果显示,联合免疫rAd5poIL-2和rAd5EGS既能增强rAd5EGS诱导小鼠特异性IgG、IgG1和IgG2a的分泌,又能增强其诱导淋巴细胞增殖能力,且免疫效果强于灭活疫苗;细胞因子检测结果显示,联合免疫rAd5poIL-2后能增强rAd5EGS诱导小鼠IL-4和IFN-γ的分泌,且其诱导IL-4和IFN-γ分泌能力也强于灭活疫苗。说明重组IL-2能有效增强FMDV多表位疫苗诱导抗体分泌能力和细胞免疫应答,rAd5poIL-2有望作为FMDV表位疫苗的候选佐剂。

腹腔内注射IL-2重组腺病毒、IL-3重组腺病毒增强化疗药物抗白血病作用的研究

对实验性白血病小鼠模型大剂量化疗后,直接腹腔注射IL-2重组腺病毒(Ad-IL-2)和/或IL-3重组腺病毒(Ad-IL-3),发现腹腔注射对照腺病毒载体小鼠虽经大剂量化疗,仍有大量白血病细胞浸润至骨髓、血管、肝脏及脾脏。而腹腔注射Ad-IL-2或Ad-IL-3组小鼠肿瘤生长缓慢,注射Ad-IL-2组小鼠脾NK、CTL活性显著提高,注射Ad-IL-3组小鼠腹腔巨噬细胞数量及杀伤活性明显提高,联合应用Ad-IL-2,Ad-IL-3组小鼠抗白血病作用最为明显,骨髓中虽然仍见白血病细胞,但可见较多正常造血细胞,且肝、脾中未见白血病细胞浸润。表明腹腔内注射Ad-IL-2和Ad-IL-3可显著增强大剂量化疗对白血病的治疗效果。

联合IL-2基因和B7-1基因转染G422细胞体外生物学特性

目的 通过研究联合基因转染后胶质母细胞瘤G42 2细胞生物学特性的变化 ,探讨脑胶质瘤细胞因子基因治疗的新途径。方法 通过重组腺病毒作载体 ,将IL 2基因和B7 1基因转染至小鼠G42 2细胞 ,通过CTLL 2细胞增殖的MTT法检测IL 2的分泌水平 ,FACS检测B7 1和ICAM 1的表达 ,MTT法检测转基因后G42 2细胞的增殖活性 ,双层琼脂糖培养法检测其克隆形成能力。结果 IL 2基因转染 4小时后即可检测到IL 2的分泌 ,2 4小时达高峰 ( 4 83U/ml) ,一周时表达明显下降 ,B7 1高表达 ,ICAM 1表达增加 ,增殖能力和克隆形成能力无变化。结论 重组腺病毒作载体 ,IL 2基因及B7 1基因共转染G42 2细胞 ,能得到目的基因的高效表达 ,同时促进了粘附分子ICAM 1的表达 ,体外增殖活性不受影响。

人IL-2复制缺陷型重组腺病毒的构建和鉴定

目的构建含hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒。方法将hIL-2DNA片段与载体pDNR-Dual-CMV融合,转化大肠杆菌DH5α。得到重组质粒(pDNR-Dual-hIL-2),经鉴定正确,将pDNR-Dual-hIL-2质粒与pLP-Adeno-x-CMV质粒重组得到重组载体pLP-Adeno-hIL-2,再次转化大肠杆菌DH5α,挑取正确克隆,大量扩增,提取质粒。将此质粒经PacⅠ酶切后与LipofectamineTM2000转染HEK293细胞,产生含人IL-2的复制缺陷重组腺病毒(AdhIL-2)。结果pLP-Adeno-hIL-2重组载体经PCR、酶切鉴定结果与预期相符,所得重组病毒滴度达到5×107PFUml。结论成功构建了hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒。

表达猪白介素2基因重组腺病毒的构建及其免疫增强作用

以猪白介素2基因(pIL-2)为研究对象构建表达pIL-2的重组腺病毒,并研究其作为细胞因子佐剂的免疫增强作用。用RT-PCR的方法扩增pIL-2基因,将pIL-2基因克隆到腺病毒穿梭载体AdTrack中,构建出重组腺病毒穿梭质粒AdTrack-pIL-2,然后在大肠杆菌BJ5183内和骨架载体AdEasy同源重组,获得重组腺病毒骨架载体AdEasy-pIL-2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-pIL-2,并通过兔体交互试验来检测Ad-pIL-2的免疫增强作用。经PCR、RT-PCR和Western blot检测,成功构建了Ad-pIL-2,病毒滴度可以达到108.25pfu/mL,并通过兔体交互免疫试验证明Ad-pIL-2可以提高兔的抗体水平。用腺病毒构建的Ad-pIL-2在兔体上具有免疫增强作用,为下一步的猪体试验研究和细胞因子佐剂的开发奠定基础。

表达猪白细胞介素2重组腺病毒的构建

为构建表达猪白细胞介素2(IL-2)的复制缺陷型重组腺病毒,本研究提取经刀豆球蛋白A(Con A)刺激体外培养的长白猪外周血淋巴细胞总RNA,利用RT-PCR扩增猪IL-2基因,并克隆于质粒pIRES2-EGFP中,将含有IL-2及EGFP的基因片段亚克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315中,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-IL-2-EGFP。利用脂质体转染方法将pDC315-IL-2-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞。根据腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP的荧光信号筛选重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP。经western blot鉴定,结果表明获得了一株能够表达猪IL-2蛋白的重组腺病毒rAd-IL-2-EGFP。本研究为进一步研究猪IL-2在疫苗免疫中的增强作用及研制新型免疫增强剂奠定了基础。

白介素2重组腺病毒气管内应用治疗实验性肺转移癌的研究

为研究气管内应用白介素 2 (IL 2 )重组腺病毒 (AdIL 2 )对实验性肺转移癌的治疗作用 ,向小鼠气管内滴入AdIL 2 ,用ELISA法测定局部及外周血IL 2及相关因子的水平 ,并向C5 7BL/ 6小鼠尾静脉注射Lewis肺癌 3LL细胞建立肺转移癌模型 ,观察气管内应用AdIL 2对实验性肺转移癌的治疗作用 ,包括肺转移结节、动物存活期、生存率变化等 ,并比较自然杀伤活性 (NK)和特异性细胞毒(CTL)活性的变化。结果显示 ,气管内应用AdIL 2后肺灌洗液中测到IL 2且高于外周血水平 ,对照组肺灌洗液及外周血中的水平明显低于实验组 (P <0 0 1) ;气管内滴入AdIL 2可使肺转移结节减少、动物的生存期延长、存活率升高 ,同时对NK、CTL活性有增强作用 (P<0 0 1)。提示气管内应用IL 2重组腺病毒可有效表达并对实验性肺转移癌有治疗作用 。

IL-2和(或)IL-3重组腺病毒直接体内注射对大剂量化疗后小鼠造血功能恢复的影响

目的：检测应用直接腹腔注射白细胞介素２（ＩＬ－２）重组腺病毒和（或）白细胞介素３（ＩＬ－３）重组腺病毒方法对化疗后小鼠造血功能恢复的影响。方法：正常小鼠腹腔注射大剂量环磷酰胺（２００ｍｇ／ｋｇ）２４小时后，直接腹腔注射ＩＬ－２重组腺病毒（Ａｄ－ＩＬ－２）和（或）ＩＬ－３重组腺病毒（Ａｄ－ＩＬ－３），用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测相应细胞内细胞因子ｍＲＮＡ，并持续观察小鼠外周血白细胞、股骨单个核细胞、骨髓ＣＦＵ－ＧＭ的恢复情况。结果：腹腔注射Ａｄ－ＩＬ－２和（或）Ａｄ－ＩＬ－３组小鼠腹腔细胞可测及相应细胞因子ｍＲＮＡ，血清中可测及相应细胞因子；腹腔注射Ａｄ－ＩＬ－３组小鼠外周血白细胞、股骨单个核细胞、骨髓ＣＦＵ－ＧＭ最低值均显著提高（Ｐ＜０．０５），但腹腔注射Ａｄ－ＩＬ－２组小鼠对化疗后小鼠造血功能无明显影响，联合应用Ａｄ－ＩＬ－２和Ａｄ－ＩＬ－３与单独应用Ａｄ－ＩＬ－３相比无显著性差异。结论：腹腔直接注射Ａｄ－ＩＬ－３能促进化疗后小鼠造血功能的恢复。

共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为研制猪瘟活载体疫苗,构建共表达猪瘟病毒E2基因和猪白细胞介素2基因的重组腺病毒并研究其免疫原性。应用PCR方法从pMD19-T-E2质粒和pMD19-T-pIL2质粒中分别扩增E2基因和pIL-2基因,将扩增的全长E2基因和pIL-2的编码区基因序列通过柔性接头序列(5个甘氨酸密码子)串联,插入腺病毒穿梭载体AdTrack中,在受体菌中与骨架载体AdEasy同源重组。重组质粒AdEasy-E2-pIL-2转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒rAd-E2-pIL-2。用rAd-E2-pIL-2免疫家兔,经兔体交互免疫试验评定其免疫效果。结果显示,经RT-PCR和West-ern blot检测,成功构建了rAd-E2-pIL-2,重组病毒滴度达108.12PFU/mL。rAd-E2-pIL-2接种家兔后刺激接种兔产生猪瘟病毒特异性抗体,淋巴细胞转化试验结果显示猪瘟病毒诱导兔淋巴细胞特异性增殖,攻毒后rAd-E2-pIL-2接种兔和猪瘟病毒C株接种兔均未出现定型热反应。研究结果表明,rAd-E2-pIL-2免疫兔可以预防猪瘟病毒C株接种引发的体温反应,rAd-E2-pIL-2可望成为猪瘟候选疫苗。

重组人干扰素联合丙种球蛋白治疗腺病毒肺炎患儿临床疗效及对免疫功能的影响

目的探究重组人干扰素联合丙种球蛋白治疗腺病毒肺炎患儿临床疗效及对免疫功能的影响。方法选取2018年6月-2020年6月黄河三门峡医院收治的100例腺病毒肺炎患儿作为研究对象,按照随机数字表法分为观察组(n=50)和对照组(n=50)。其中对照组给予丙种球蛋白治疗,观察组给予重组人干扰素联合丙种球蛋白治疗。采用酶联免疫吸附法检测患儿血清白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)水平,以免疫比浊法检测患者血清IgA、IgG、IgM水平,以流式细胞仪检测患者CD3、CD4、CD8水平,并分析两组临床疗效。结果治疗后3、7 d,观察组患儿血清IL-2、IL-6、sIL-2R水平较治疗前均明显降低(t=5.775/15.406、11.336/24.522、16.511/38.519,P均<0.05),且观察组患儿不同时间段血清IL-2、IL-6、sIL-2R水平较对照组均明显降低(t=5.083/12.182、11.377/16.157、15.262/29.228,P均<0.05),差异均有统计学意义。治疗后7 d,对照组血清IL-2、IL-6、sIL-2R水平较治疗前明显降低,差异均有统计学意义(t=5.829、12.829、14.386,P均<0.05)。治疗后3、7 d,观察组患儿血清IgG、CD3、CD4、CD8水平较治疗前均明显升高(t=10.449/15.714、4.588/15.289、11.056/18.276、11.902/18.177,P均<0.05),且观察组在治疗后不同时段均明显高于对照组(t=8.002/12.763、2.383/2.701、6.425/2.623、4.555/3.606,P均<0.05),差异均有统计学意义。两组血清IgM、IgA水平及对照组IgG水平治疗前后比较差异无统计学意义(P均>0.05)。观察组住院时间、咳嗽、体温、气促、啰音等症状消失时间明显低于对照组,差异均有统计学意义(t=2.292、2.615、3.365、2.277、3.127,P均<0.05)。观察组总有效率为91.30%,明显高于对照组的72.73%,差异有统计学意义(χ^(2)=4.115,P<0.05)。结论重组人干扰素联合丙种球蛋白治疗腺病毒肺炎可有效降低炎症反应,提高患儿免疫力,改善临床症状,减少住院时间,疗效显著。