白介素-1受体相关激酶-M在脂多糖预处理减轻慢性肝损伤机制中的作用

目的:探讨脂多糖(LPS)预处理对四氯化碳(CCl4)诱导的慢性肝损伤的影响及肝组织中白介素-1受体相关激酶-M(I-RAK-M)表达的变化。方法:雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、肝损伤组和LPS预处理组。制备肝切片,计数浸润肝组织的淋巴细胞;测定血浆内毒素水平和丙氨酸转氨酶(ALT)活性、肝组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;免疫印迹法测定肝组织中p38丝裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)和IRAK-M表达。结果:LPS预处理可明显减轻CCl4所致的慢性肝损伤,经LPS预处理动物肝组织切片淋巴细胞计数、血浆ALT水平与肝损伤组比较均显著降低;肝匀浆的TNF-α测定结果表明,LPS预处理组TNF-α含量明显低于肝损伤组。LPS处理组pp38MAPK的表达比肝损伤组显著减弱,而IRAK-M表达显著增强。结论:LPS预处理可以减轻CCl4诱导的慢性肝损伤,其机制可能是IRAK-M负性调节LPS信号转导通路,致使致炎因子分泌减少。

白藜芦醇对人白细胞介素-1受体相关激酶-M基因表达的抑制作用及其机制

目的探讨白藜芦醇对人白细胞介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)基因表达的抑制作用及其分子机制。方法用不同浓度的白藜芦醇分别作用于转染神经前体细胞表达发育调控样蛋白4(Nedd4L)-HA或IRAK-M-Flag质粒的Hela细胞和人单核细胞株THP1细胞,处理20 h后采用Western印迹法检测其Nedd4L和IRAK-M的表达。在A549和Hela细胞中分别共转染IRAK-M-Flag和不同浓度的Nedd4L-HA表达质粒,36 h后采用Western印迹法检测IRAK-M和Nedd4L的表达。用IRAK-M-Flag和Nedd4L-HA表达质粒分别单独转染、共同转染至Hela细胞,36 h后用细胞裂解液处理细胞,采用免疫共沉淀法检测IRAK-M与Nedd4L的相互作用。在A549细胞中分别共转染IRAK-M-Flag和Nedd4L-HA表达质粒,36 h后采用免疫荧光法检测IRAK-M和Nedd4L的共定位情况。结果 Hela细胞中分别转染2μg外源Nedd4L-HA或IRAK-M-Flag质粒24 h后,0、10、20μmol/L白藜芦醇处理20 h,Western印迹法检测结果显示,10、20μmol/L白藜芦醇处理组的Nedd4L-HA蛋白质相对表达量均显著高于0μmol/L白藜芦醇处理组(P值均<0.01),而10、20μmol/L白藜芦醇处理组IRAK-M-Flag蛋白质相对表达量均显著低于0μmol/L白藜芦醇处理组(P值均<0.05),且20μmol/L白藜芦醇处理组显著低于10μmol/L白藜芦醇处理组(P<0.01)。0、10、20μmol/L白藜芦醇处理THP1细胞20 h,Western印迹法检测结果显示,10、20μmol/L白藜芦醇处理组的Nedd4L蛋白质相对表达量均显著高于0μmol/L白藜芦醇处理组(P值均<0.01),而IRAK-M蛋白质相对表达量均显著低于0μmol/L白藜芦醇处理组(P值均<0.05)。在A549和Hela细胞中分别转染1μg的IRAK-M-Flag和不同质量(0、0.5、1μg)的Nedd4L-HA表达质粒,Western印迹法结果显示,在A549细胞中,0.5、1μg Nedd4L-HA转染组的IRAK-M-Flag蛋白质相对表达量均显著低于0μg Nedd4L-HA转染组(P值均<0.01);在Hela细胞中,0.5、1μg Nedd4L-HA转染组的IRAK-M-Flag蛋白质相对表达量均显著低于0μg Nedd4L-HA转染组(P值均<0.01)。用IRAK-M-Flag、Nedd4L-HA表达质粒分别单独转染、共同转染至Hela细胞中,免疫共沉淀检测结果显示,在共表达IRAK-M和Nedd4L的细胞裂解物中,用抗Flag的抗体能将Nedd4L-HA沉淀下来,用抗HA的抗体同样能将IRAK-M-Flag沉淀下来。将表达质粒IRAK-M-Flag和Nedd4L-HA共同转染至A549细胞中,36 h后免疫荧光检测结果显示,在共转染的细胞中,可观察到绿色荧光和红色荧光以重叠形式分布于细胞膜和细胞质中。结论白藜芦醇可抑制IRAK-M蛋白的表达,其作用机制可能与Nedd4L蛋白的表达上调有关。

IRAK-M短发夹RNA对RAW264.7细胞内毒素耐受性的抑制作用

目的:观察白介素-1受体相关激酶-M(IRAK-M)基因沉寂后RAW264.7细胞内毒素耐受性的改变,进而探讨IRAK-M在内毒素耐受形成中的作用.方法:构建表达IRAK-M短发夹RNA(shRNA)的阳性重组质粒(pshIRAK-M-A)和阴性重组质粒(pshIRAK-M-B),转染RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞系)细胞;各组细胞经10μg/L脂多糖(LPS)预处理24h后(或直接)用100μg/LLPS刺激;3h后,酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养液中TNF-α水平,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中的TNF-α mRNA表达水平,蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞中IRAK-M蛋白的表达,凝胶电迁移率分析法(EMSA)检测细胞中NF-κB的活性.结果:pshIRAK-M-A对IRAK-M蛋白表达抑制率为83%左右,pshIRAK-M-B对IRAK-M蛋白表达无明显抑制作用;两种转染细胞在用100μg/LLPS直接刺激后,其培养液中TNF-α水平、细胞内TNF-α mRNA表达及NF-κB活性无显著性差异;两种转染细胞对LPS的再次应答均明显弱于初次应答细胞(P<0.05),但pshIRAK-M-A转染组细胞对LPS的再次应答明显强于pshIR AK-M-B转染组细胞(P<0.05).结论:IRAK-M表达受抑导致细胞内毒素耐受性减弱,IRAK-M在内毒素耐受形成中起重要作用.

脐带血IRAK-M基因多态性与新生儿早产及主要并发症的关系

目的探讨脐带血白细胞介素1受体相关激酶-M(interleukin-1 receptor-associatd kinase-M,IRAK-M)基因多态性与新生儿早产及主要并发症的关系。方法选择2015年1月~2017年12月本院出生的≤34周的早产儿200例为研究对象,母亲分娩时取脐带血,测定IRAK-M基因位点多态性;记录早产儿的临床资料,分析IRAK-M基因多态性与早产儿主要并发症的关系。结果 200例早产儿中主要住院情况有创机械通气治疗、吸氧治疗、肺表面活性物质应用、低血压或休克、败血症、发生呼吸暂停。早产儿的IRAK1主要基因分型为rs3027898 (CC、AC或AA3种基因型)和rs1059703(CC、CT或TT3种基因型)。rs3027898 (AC+AA)和rs1059703 (CT+TT)增加了RDS的发生率,rs3027898(AC+AA)增加了ROP发生率,差异有统计学意义(P<0.05)。结论测定脐带血IRAK-M基因多态性可以影响早产儿的主要并发症,有助于评估患儿预后。

负性调控因子IRAKM在系统性红斑狼疮免疫调节异常中的作用

目的:研究白介素-1受体相关激酶-M(IRAKM)在系统性红斑狼疮(SLE)中的表达及其与免疫调节的关系。方法:将103例SLE患者根据其疾病活动度评分(SLEDAI)分为活动期组(55例)和稳定期组(48例),另选40名体检健康者作为对照组;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测3组外周血单核细胞中IRAKM mRNA的表达量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体水平,免疫散射比浊法测定血清补体C3、C4水平;应用单因素方差分析法分析3组各观察指标的差异,Pearson或Spearman分析IRAKM与SLE自身抗体及补体的相关性。结果:活动期组和稳定期组SLE患者的IRAKM mRNA表达量均明显低于对照组(P<0.05),且活动期组比稳定期组更低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比,活动期组和稳定期组血清抗ds-DNA抗体和抗Sm抗体水平均明显升高(P<0.05),补体C3、C4的水平均明显降低(P<0.05),且活动期组血清自身抗体和补体水平变化较稳定期组更显著(P<0.05);SLE患者的IRAKM mRNA表达量与抗ds-DNA抗体和抗Sm抗体水平呈负相关(P<0.05),与补体C3、C4水平呈正相关(P<0.05)。结论:IRAKM负性调控参与SLE的免疫调节过程,其表达水平与SLE病情活动程度密切相关。

血必净对内毒素刺激的THP-1细胞的影响

目的观察血必净对内毒素刺激的THP-1细胞的影响,并探究其是否具有诱导内毒素耐受的作用。方法THP-1细胞先以不同浓度的血必净(10,25,50mg/mL)作用不同时间(4,12,24h),再用内毒素进行刺激。用ELISA法测定上清液中TNF-α水平,Realtime-PCR技术检测TLR4和IRAK-M mRNA的表达差异。结果不同浓度血必净不同时间作用下,各实验组细胞TNF-α分泌水平均无显著变化(P>0.05)。在高浓度(50mg/mL)血必净组,作用24h时细胞TLR4表达上调,是4h时的1.547倍(P<0.05);在作用24h后,50mg/mL血必净组IRAK-M表达上调,是对照组的1.349倍(P<0.05);但其余各浓度及时间组细胞的TLR4和IRAK-M mRNA表达均无显著差异(P>0.05)。结论血必净不能阻断内毒素刺激的THP-1细胞TNF-α的分泌,不能诱导内毒素耐受;高浓度血必净长时间作用后虽可能上调THP-1细胞TLR4和IRAK-M mRNA表达,但确切含义仍不清楚。

TET2上调IRAK-M表达促进巨噬细胞内毒素耐受

目的:研究TET2蛋白(ten-eleven translocation 2)对巨噬细胞白介素-1受体相关激酶-M(interleukin-1 receptor-associated kinase-M,IRAK-M)表达的影响,探讨细菌内毒素(endotoxin/lipopolysaccharide,LPS)刺激诱导TET2表达的上游信号通路。方法:用LPS刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7诱导内毒素耐受,qPCR和Western blot检测LPS刺激不同时间点和内毒素耐受时IRAK-M和TET2表达;用siRNA干扰TET2表达,qPCR和Western blot检测对IRAK-M表达的影响;用促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路抑制剂预处理细胞,再用LPS刺激,qPCR和Western blot检测对TET2表达的影响。结果:TET2蛋白和IRAK-M在LPS刺激RAW264.7细胞诱导内毒素耐受后仍持续表达,且表达模式都和细胞因子表达模式相反;干扰TET2表达抑制IRAK-M m RNA(P=0.000)和蛋白水平表达;抑制MAPK信号通路抑制TET2表达。结论:巨噬细胞炎症反应过程中MAPK信号通路上调TET2表达,TET2通过促进IRAK-M表达促进内毒素耐受。

IRAKM及IL-1Rα基因多态性与感染性休克的关联

目的 分析感染性休克与白细胞介素受体-1相关激酶-M(IRAKM)及白细胞介素-1受体α(IL-1Rα)基因多态性的关联。方法 选取2020年1月-2022年3月武汉市第一医院收治的感染性休克患者81例为研究组,脓毒症未合并感染性休克患者85例为对照组,其中感染性休克患者根据28 d死亡情况分为病死组和存活组。采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)和PCR技术检测外周血IRAKM、IL-1Rα(对应基因IL-1RN)基因多态性,比较各组上述基因分型结果,并分析其与急性生理与慢性健康Ⅱ(APACHEⅡ)评分、序贯器官衰竭(SOFA)评分及重症监护室(ICU)住院时间的关系。结果 研究组IRAKM+22148位点GG基因型及G等位基因分布、IL-1RN*1,2基因型及等位基因2分布频率高于对照组(P<0.05),IRAKM+22148位点GG基因型及G等位基因、IL-1RN*1,2基因型及等位基因2是感染性休克发生的危险因素(P<0.05);病死组IRAKM+22148位点G等位基因分布频率高于存活组(P<0.05),是感染性休克患者病死的危险因素(P<0.05);IRAKM+22148位点GG型患者APACHEⅡ、SOFA评分、CRP及PCT水平高于AA型、AG型(P<0.05);IL-1RN*1,2型SOFA评分、CRP及PCT水平高于1,1型、其他型(P<0.05)。结论 IRAKM+22148位点G等位基因、IL-1RN等位基因2与患者感染性休克密切相关,还会增加患者不良预后的风险。

补阳还五汤减轻脑梗死小鼠神经损伤的作用机制

目的研究白细胞介素1受体相关激酶M(IRAKM)在脑缺血-再灌注小鼠模型中介导补阳还五汤的脑保护作用。方法制备45 min小鼠大脑中动脉梗死(MCAO)模型,观察补阳还五汤在假手术和模型小鼠脑内诱导IRAKM的表达情况,多普勒监测大脑中动脉区域血流,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测IRAKM基因敲除小鼠脑内炎症因子的表达,TTC染色以显示脑梗死体积,并分别在给药组和对照组间、基因敲除和同笼繁殖野生小鼠间进行对比。结果补阳还五汤在假手术和脑梗死小鼠中均能显著诱导IRAKM基因表达。IRAKM基因缺失导致炎症因子转录激活进一步增强,包括肿瘤坏死因子(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧化酶(COX-2)。IRAKM基因敲除可明显加剧脑梗死的组织损伤并削弱补阳还五汤的脑保护作用。结论补阳还五汤可通过诱导IRAKM在脑内的表达发挥脑保护作用。

白细胞介素1受体相关激酶M在脓毒症免疫麻痹中的作用

背景 白细胞介素1受体相关激酶M（interleukin 1 receptor-associated kinase M,IRAK-M）是Toll样受体（toll-like receptor,TLR）信号通路中重要的负向调控因子,可通过抑制NF-κB炎症信号通路来限制过度的炎症反应. 目的 通过研究IRAK-M限制炎症反应的相关机制,可以为脓毒症免疫麻痹的具体机制提供新的思路. 内容 综述近年来关于IRAK-M对TLR通路中转化生长因子-β激活激酶1（transforming growth factor-β activated kinase-1,TAK1）依赖性与促分裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶-激酶3 （mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase-kinase 3,MEKK3）依赖性的通路,并综述IRAK-M被众多TLR分子、细胞因子调控表达及其本身的表观遗传调控方面的机制. 趋向 现有研究初步阐述了IRAK-M可能通过抑制炎症反应通路而加重脓毒症免疫麻痹的相关病理机制,并提示IRAK-M可能作为脓毒症患者免疫状态和免疫调节治疗的靶点.

白细胞介素-1受体相关激酶M抑制p22phox调控脂多糖诱导的小鼠腹腔巨噬细胞呼吸爆发

目的 研究白细胞介素-1受体相关激酶M(interleukin-1 receptor-associated kinase M, IRAK-M)是否调控p22phox介导脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导的巨噬细胞呼吸爆发. 方法 分离、培养小鼠腹腔巨噬细胞,细胞贴壁后分为内毒素耐受(endotoxin tolerance, ET)组和对照组(NC组). ET组预先10 μg/L LPS刺激2 h后,予100 μg/L LPS再刺激,NC组不作预先处理,直接100 μg/L LPS刺激,3 h后收集上清液,ELISA法检测TNF-α和IL-6水平,试剂盒检测过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)水平;细胞裂解后提取蛋白,Western blot法检测IRAK-M和p22phox蛋白表达.采用IRAK-M 小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)干扰IRAK-M,分组为:LPS刺激组(NC-control组)、干扰IRAK-M+LPS刺激组(NC-si-IRAK-M组)、内毒素耐受组(ET-control组)和干扰IRAK-M+内毒素耐受组(ET-si-IRAK-M组),PCR检测干扰效率并再次检测IRAK-M和p22phox的蛋白表达.IRAK-M干扰成功后,分组为:二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)+内毒素耐受组(control-placebo组)、夹竹桃麻素(apocynin)+内毒素耐受组(control-apocynin组)、DMSO+干扰IRAK-M+内毒素耐受组(si-IRAK-M-placebo组)和干扰IRAK-M+apocynin+内毒素耐受组(si-IRAK-M-apocynin组),采用apocynin抑制p22phox,再次取上清液检测TNF-α、IL-6以及H2O2、O2-水平. 结果 与NC组比较,ET组TNF-α、IL-6水平和H2O2、O2-水平均降低,p22phox表达水平降低,而IRAK-M表达水平升高(P<0.05);干扰IRAK-M后,与ET-control组比较,ET-si-IRAK-M组蛋白水平明显降低,p22phox的蛋白水平明显升高(P<0.05);干扰IRAK-M并抑制p22phox后,与si-IRAK-M-placebo组比较,si-IRAK-M-apocynin组TNF-α、IL-6和H2O2、O2-的水平明显降低(P<0.05). 结论 IRAK-M通过抑制p22phox对内毒素诱导的小鼠巨噬细胞呼吸爆发产生负向调控作用.

白细胞介素-1受体相关激酶-M在慢性阻塞性肺疾病急性发作中的免疫调节作用

目的探讨白细胞介素-1受体相关激酶-M(interleukin-1 receptor associated kinases M,IRAK-M)在慢性阻塞性肺疾病急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)对炎症反应的免疫调节作用。方法选择2019年5月至2021年5月在四川省人民医院老年呼吸科住院明确诊断为AECOPD患者30例纳入A组,门诊随访的慢性阻塞性肺疾病稳定期患者30例纳入B组,在本院进行健康体检的体检者30例纳入C组。抽血三组研究对象静脉血,提取单核细胞,应用实时荧光定量PCR仪检测各组研究对象单核细胞中IRAK-M、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR-4)的mRNA表达,采用酶联免疫吸附法检测各组研究对象血清中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)水平。结果AECOPD患者单核细胞中IRAK-M、TLR4的mRNA表达量均明显高于稳定期组及健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.01);慢阻肺稳定期组及健康对照组IRAK-M、TLR4的mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)。AECOPD患者时血清IL-6、IL-10和hs-CRP水平明显高于稳定期组及健康对照组,差异均有统计学意义(P<0.01),慢阻肺稳定期组与健康对照组血清IL-6、IL-10和hs-CRP水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论在慢阻肺急性发作时,机体可能通过上调IRAK-M水平来调控炎症反应强度,从而避免过强的炎症反应对机体的伤害。

四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织Toll样受体4及其负性调控因子IRAK-M表达的影响

目的:观察Toll样受体4(TLR4)及其负性调控因子白细胞介素-1受体相关激酶M(IRAK-M)在实验性溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠结肠黏膜中的表达,并探讨四神丸干预UC的作用机制。方法:将90只Wistar大鼠随机分成6组,即空白组,模型组,柳氮磺胺嘧啶组(0. 36 g·kg^-1),四神丸低、中、高剂量组(2. 5,5,10 g·kg^-1),每组15只。以三硝基苯磺酸/乙醇溶液法制备UC大鼠模型,苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠结肠组织病理学改变;采用放射免疫法测定血清游离三碘甲腺原氨酸(FT3),血清游离甲状腺素(FT4),免疫球蛋白(Ig) E,白细胞介素(IL)-2的含量;采用黄嘌呤氧化法测定大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定大鼠血清丙二醛(MDA)的活性。采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR),免疫组化和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测TLR4,IRAK-M的mRNA及蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠肠黏膜损伤评分显著增高(P <0. 01),大鼠血清Ig E,MDA含量显著升高(P <0. 01),FT3,FT4,IL-2,SOD表达水平显著下降(P <0. 01),TLR4 mRNA和蛋白表达显著升高(P <0. 01),IRAK-M mRNA和蛋白表达显著降低(P <0. 01);与模型组比较,各治疗组鼠肠黏膜损伤评分均显著降低(P <0. 01),Ig E,MDA含量明显下降(P <0. 05,P <0. 01),FT3,FT4,IL-2,SOD水平明显升高(P <0. 05,P <0. 01),TLR4 mRNA和蛋白表达明显降低(P <0. 05,P <0. 01),IRAK-M mRNA和蛋白表达水平显著升高(P <0. 01)。结论:UC的发病机制与TLR4及其负性调控因子IRAK-M的表达失衡有关,且四神丸可能通过抑制TLR4mRNA和蛋白的表达,促进其负性调控因子IRAK-M的表达,起到有效治疗UC的作用。

脓毒症与IRAKM基因多态性的相关性

目的探讨人IRAKM+22148位点的基因多态性与脓毒症易感性和预后的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析法(RFLP)进行基因多态性分析。比较病例组与对照组基因型频率及等位基因频率分布差异,分析IRAKM+22148位点基因多态性与脓毒症易感性的关系。计算等位基因OR值和95%可信区间评价其相对患病风险。比较脓毒症患者存活组与死亡组的基因型频率及等位基因频率,分析IRAKM+22148位点基因多态性是否与脓毒症预后相关。结果病例组与对照组比较基因型频率分布差异无统计学意义(P>0.05)。而两组间G等位基因频率差异具有统计学意义(P<0.05)。OR=2.24(95%CI 1.25-4.00)。脓毒症患者存活组与死亡组比较,基因型频率和G等位基因频率,差别皆无统计学意义(P>0.05)结论 IRAKM+22148位点G等位基因可能是脓毒症易感基因。未发现脓毒症病死率与IRAKM+22148位点基因变异相关。