真核表达的重组猪单链IL-12生物学活性的研究

目的:真核表达重组猪单链IL-12(pscIL-12)并鉴定表达的pscIL-12的生物学活性。方法:采用梭华-SofastTM将pcDNA3.1(+)-pscIL-12转入CHO-K1细胞,ELISA法测定细胞培养上清中pscIL-12的表达水平;MTT法检测细胞培养上清对NK细胞杀伤作用的影响;ELISA法测定细胞培养上清刺激人PBMC分泌IFN-γ的水平;流式细胞术(FCM)检测细胞培养上清对人淋巴母细胞增殖水平的作用。结果:融合基因pscIL-12在CHO-K1细胞中表达产物pscIL-12融合蛋白含量较高;生物学活性鉴定表明:pscIL-12融合蛋白可增强NK细胞活性、提高IFN-γ的产生和促进人淋巴母细胞的增殖。结论:转染pcDNA3.1(+)-pscIL-12质粒的CHO-K1细胞成功表达了具有良好生物学活性的pscIL-12。

GPI锚定修饰的慢粒白血病bcr/abl和鼠IL-12真核双表达质粒的构建及表达

目的:构建由糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定修饰的bcr/abl和鼠IL-12(mIL-12)真核双表达质粒,在COS-7细胞中检测其基因和膜蛋白表达.方法:以含有慢粒白血病(b3a2型)migP210全长序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得654bp的bcr/abl融合基因片段,酶切后插入pBudCE4.1空载中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时,RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI锚定序列,酶切后克隆入pBB质粒中与bcr/abl基因片断羧基端相连,获得重组质粒pBBG并鉴定.然后扩增mIL-12基因片段并亚克隆入pBBG另一多克隆位点,构建重组质粒pBBGI.在多聚阳离子介导下将pBBGI质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR,Western Blot检测bcr/abl融合基因及其蛋白的表达,ELISA检测mIL-12的表达.结果:经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的bcr/abl及mIL-12基因插入片段正确;转染细胞中有bcr/abl融合基因、转染细胞膜上有bcr/abl融合蛋白的表达,细胞培养上清中也有mIL-12的表达.结论:成功构建能在真核细胞中表达bcr/abl和mIL-12的重组质粒PBBGI,为进一步研究bcr/abl基因疫苗诱导肿瘤特异性细胞免疫奠定了基础.

米非司酮调控的单链鼠白介素12真核表达载体的构建及鉴定

构建含有单链鼠白细胞介素12(mIL-12)基因,并可经米非司酮调控表达的真核载体,在体外鉴定其调控表达效果。用PCR技术从GCp35Ep40PN质粒上获取白细胞介素12的p40和p35亚基的基因,通过2次PCR技术引入linker后得到单链白细胞介素12基因,将其与米非司酮诱导调控系统克隆入pDC312质粒,构建成真核表达载体pDC-RUmIL-12,通过限制性内切酶和PCR鉴定其正确性。在体外用脂质体转染法将pDC-RUmIL-12载体转染HEK293细胞株,以不同的剂量米非司酮诱导载体表达,然后用ELISA法检测培养液上清中mIL-12蛋白的含量。测序结果表明所得鼠白细胞介素-12融合单链基因序列与设计相一致。酶切分析和PCR证实载体pDC-RUmIL-12构建正确。将pDC-RUmIL-12转染HEK293细胞并经米非司酮诱导表达后,ELISA检测结果表明该载体有良好的调控能力。没有诱导剂米非司酮时,只有极少量的mIL-12蛋白表达,而加入诱导剂米非司酮后,mIL-12表达量明显增加,并在一定范围内与米非司酮剂量呈正比。成功构建了含有单链鼠白细胞介素12(mIL-12)基因,并可经米非司酮调控表达的真核载体,可用于肿瘤的基因治疗研究。

可调控的鼠白细胞介素-12双亚基共表达质粒的构建及在体外表达

目的构建可经米非司酮(RU486)调控表达小鼠白细胞介素-12(mIL-12)单链融合基因的真核载体,并鉴定其调控表达效果。方法以GCp35Ep40PN质粒为模板,分别获取mIL-12p40和p35亚基的基因,重叠PCR引入linker后,克隆入pCA14质粒,测序正确之后,装入可调控载体pRS-17而构建成真核表达质粒pRS-RUmIL-12。用Lipofectamine2000将pRS-RUmIL-12质粒转染HEK293细胞,以不同剂量的RU486诱导其表达,然后用ELISA法检测其培养上清液中mIL-12蛋白的含量。结果所得mIL-12单链融合基因序列与设计一致。pRS-RUmIL-12在体外转染HEK293细胞后,ELISA检测结果表明该系统具有良好的调控能力:无诱导剂RU486时,mIL-12蛋白表达量很低,而加入诱导剂RU486后,可以诱导mIL-12的表达,并在一定范围内mIL-12的蛋白表达量与诱导剂的浓度呈正相关。结论成功构建了可经RU486调控的mIL-12双亚基共表达的真核表达质粒,可用于进一步的基因调控和基因治疗研究。

小鼠IL-12单链融合基因真核表达质粒构建及其肿瘤基因治疗初探

目的 构建小鼠IL 12单链融合基因 (msIL 12 ) ,进行基因治疗初探。方法 用RT PCR法从小鼠腹腔巨噬细胞总RNA分别获取p4 0cDNA和p35cDNA ,2次PCR引入linker后 ,依次克隆入pcDNA3质粒 ,构建成msIL 12真核表达质粒 (pmsIL 12 ) ;用DEAE dextran法将PEG纯化的pmsIL 12转染COS 7细胞 ,用ELISA法检测其培养上清 (转染上清 )IL 12蛋白含量。皮内注射PEG纯化的pmsIL 12 ,用MTT法检测其对正常小鼠脾细胞NK活性的影响 ,观察其对荷H2 2腹水型肝癌细胞瘤小鼠生存期的影响。结果 所得p35cDNA序列与GenBank登录号M86 6 72完全一致 ;所得IL 12p4 0cDNA序列与GenBank登录号AH0 0 4 85 9报道完全相同 ,除第 10 0 0位碱基是G而不是A(但所编码氨基酸相同 ,都是丝氨酸 )外也与GenBank登录号M86 6 71报道相同。成功构建了小鼠IL 12单链融合基因真核表达质粒pmsIL 12 ,其转染COS 7细胞后的转染上清IL 12蛋白含量达 (2 .5 5± 0 .6 0 )ng ml。皮内注射pmsIL 12后 ,使正常小鼠脾细胞NK活性显著增强 (P <0 .0 1) ,使荷H2 2肝癌细胞瘤小鼠的生存期明显延长(P <0 .0 5 )。结论 构建了小鼠IL 12单链融合基因的真核表达质粒 ,可用于基因治疗研究。