Relationship of Intracellular Free Ca^(2+) Concentration and Calcium-activated Chloride Channels of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells in Rats under Hypoxic Conditions

To investigate the relationship between intracellular free Ca^2＋ concentration （[Ca^2＋ ]i ） and calcium-activated chloride （Clca） channels of pulmonary artery smooth muscle cells （PASMCs） in rats under acute and chronic hypoxic conditions, acute hypoxia-induced contraction was observed in rat pulmonary artery by using routine blood vascular perfusion in vitro. The fluorescence Ca^2＋ indicator Fura-2/AM was used to observe [Ca^2＋ ]i of rat PASMCs under normal and chronic hypoxic condition. The effect of Clca channels on PASMCs proliferation was assessed by MTT assay. The Clca channel blockers niflumic acid （NFA） and indaryloxyacetic acid （IAA-94） exerted inhibitory effects on acute hypoxia-evoked contractions in the pulmonary artery. Under chronic hypoxic condition, [Ca^2＋ ]i was increased. Under normoxic condition, [Ca^2＋ If was （123.634-18.98） nmol/ L, and in hypoxic condition, [Ca^2＋]i wag （281. 754-16.48） nmol/L （P〈0. 01）. Under normoxic condition, [Ca^2＋ ]i showed no significant change and no effect on Clca channels was observed （P〉 0. 05）. Chronic hypoxia increased [Ca^2＋ ]i which opened Clca channels. The NFA and IAA-94 blocked the channels and decreased [Ca^2＋ ]i from （281.75± 16.48） nmot/L to （117.66 ±15.36） nmol/L （P〈0.01）. MTT assay showed that under chronic hypoxic condition NFA and IAA-94 decreased the value of absorbency （A value） from 0. 459±0. 058 to 0. 224±0. 025 （P〈0. 01）. Hypoxia increased [Ca^2＋ ]i which opened Cl~ channels and had a positive-feedback in [Ca^2＋ ]i. This may play an important role in hypoxic pulmonary hypertension. Under chronic hypoxic condition, Clca channel may play a part in the regulation of proliferation of PASMCs.

水蛭对Ang-Ⅱ刺激鼠肝星状细胞活化Ca^(2+)效应的抑制作用

目的研究水蛭药物血清是否具有抑制肝星状细胞(HSCs)胞浆游离钙([Ca^(2+)]i)增高的作用。方法将32只健康SD大鼠按随机数字表随机分为4组肝纤维化模型水蛭组(8只)皮下注射用精制橄榄油配制的40%CCl4溶液9周,然后灌服水蛭6d;肝纤维化模型对照组(8只)皮下注射用精制橄榄油配制的40%CCl4溶液9周,然后灌服0.9%氯化钠溶液6d;正常大鼠水蛭组(8只)仅皮下注射等量的精制橄榄油9周,然后灌服水蛭6d;正常对照组(8只)仅皮下注射等量的精制橄榄油9周,然后灌服0.9%氯化钠溶液6d。结束后,经下腔静脉取血并分离血清。采用盲法用上述10%血清培养HSCs24h并负载好Fluo-3/AM后使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测HSCs[Ca2+]i。结果(1)经正常大鼠水蛭组及肝纤维化模型水蛭组大鼠血清预处理的HSCs,其[Ca^(2+)]i荧光强度相对值均明显低于肝纤维化模型对照组(P<0.05);且两者与正常对照组间差别也均有显著性意义(P<0.05)。(2)经正常大鼠水蛭组及肝纤维化模型水蛭组大鼠血清预处理HSCs后加入Ang-Ⅱ(1.1×10-7mol/L),HSCs[Ca^(2+)]i荧光强度变化百分数显著低于肝纤维化模型对照组(P<0.01)。结论水蛭能抑制肝星状细胞活化[Ca^(2+)]i的升高,此可能是其发挥抗肝纤维化作用的重要途径之一。

羟墓自由基引起神经细胞［Ca^（2＋）］i增高的机制和Ebselen的抑制作用

用Ｆｕｒａ－２显微荧光测量技术研究了羟基自由基对单个皮层神经细胞内游离钙离子浓度［Ｃａ２＋］ｉ影响和硒化合物Ｅｂｅｌｅｎ对［Ｃａ２＋］ｉ的抑制作用。结果表明羟基自由基的作用首先引起胞内［Ｃａ２＋］ｉ以时间常数τ＝３８９５．４±５０７．２Ｓ速度缓慢增加，然后加入了以τ＝４２０．６±１２２．０Ｓ的外钙大量涌入。钙通道阻断剂、疏基还原剂、疏基还原制和自由基清除剂对羟基自由基损伤作用的影响提示外钙的大量涌入部分与通道的开放有关，疏基损伤在羟基自由基引起的［Ｃａ２＋］ｉ升高中起着重要的作用。具有类谷胱甘肽过氧化酶活性的小分子硒化合物Ｅｂｓｅｌｅｎ（１０－５ｍｏｌ／Ｌ和１０－６ｍｏｌ／Ｌ）抑制羟基自由基引起的［Ｃａ２＋］ｉ升高，推测它可以抑制钙库的释放或促进内钙的外排以及抑制外钙的流入。

不同浓度中药柴胡提取物对人肝癌细胞内Ca^(2+)和p53表达的影响

目的:测定不同浓度中药柴胡(Bup leurun Ch inese DC,BCDC)提取物对BEL-7402细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)和p53表达的影响,以探索柴胡逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制。方法:用Fura-2/AM作为细胞内钙离子的荧光指示剂,用双波长荧光分光光度计测定不同浓度柴胡提取物作用下BEL-7402细胞内[Ca2+]i及其剂量-效应关系;用免疫组化法检测不同条件下BEL-7402细胞的p53表达。结果:柴胡可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降(P<0.001),但不具有剂量-效应关系;BEL-7402细胞呈p53天然突变。结论:柴胡可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降,为一种钙离子通道阻滞剂(calc ium channel b locker,CCB),提示钙离子通道阻滞作用为柴胡逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制之一;BEL-7402细胞呈p53天然突变也可直接或间接影响肿瘤多药耐药性的表达。

铅对小鼠海马[Ca^(2+)]的影响及L型钙通道的作用

目的 探讨铅对分离的小鼠海马细胞内游离钙的影响及其及L型钙通道的作用。方法 采用低浓度胰蛋白酶消化法分离小鼠海马细胞 ,并以莹光指标剂 (Fura 2 )作Ca2 + 荧光探针 ,用双波长荧光法测定海马细胞 [Ca2 + ] i。结果 铅可致分离的小鼠海马细胞 [Ca2 + ] i 升高 [由静息时的 (2 0 3 4± 10 86)nmol L升至 (4 2 3 3± 19 2 6)nmol L] ,而不论胞外是否有钙 ;铅可抑制钾诱发海马细胞 [Ca2 + ] i 升高 ,尼莫地平可加强这种抑制作用 ,而BayK864 4则可部分消除这种抑制作用。结论 铅可致分离的小鼠海马细胞 [Ca2 + ] i 升高作用与胞内钙库释放有关 ;铅的抑制钾诱发海马细胞 [Ca2 + ] i 升高作用与其抑制L型钙通道有关。

下丘脑神经元中游离Ca^(2+)的电生理测定法

目的 采用膜片钳技术通过对SD乳鼠下丘脑神经元上Ca2 + 激活K+ 通道 (KCa)Ca2 + 敏感性的研究测定其细胞内游离Ca2 + 浓度 ([Ca2 + ]i)。方法 首先应用内面向外式研究不同 [Ca2 + ]i 时KCa通道的开放概率 (P0 ) ,作出量效曲线 ,再应用细胞贴附式求得生理状态下此通道的开放概率 ,从量效曲线上查出的细胞内游离Ca2 + 浓度。结果 试验表明SD乳鼠下丘脑神经元上KCa通道的P0 具有对 [Ca2 + ]i 的高度敏感性 ,求得下丘脑神经元内的 [Ca2 + ]i 为 0 1μmol/L。 结论 实验结果说明此电生理法测定 [Ca2 + ]i 具有较高的可靠性和准确性。

Fura-2/AM法测定突触体内游离Ca^(2+)浓度的方法

采用新型Ｃａ２＋荧光指示剂Ｆｕｒａ－２，测定冷冻伤性脑水肿时突触体内游离钙的离子浓度。

用Fura 2－AM检测血小板胞浆游离钙浓度

本文对应用荧光指示剂Ｆｕｒａ２－ＡＭ（国产）测定血小板胞浆游离钙浓度的某些实验条件进行了探讨。结果表明：实验最适ｐＨ范围为７．３５～７．４５。实验不受溶血、黄疸及高脂血样品的干扰。批内ＣＶ４．９８％，批间ＣＶ５．６％。正常成人参考值为１６７．７５±２０．６６ｎｍｏｌ／Ｌ。与使用进口Ｆｕｒａ２－ＡＭ（Ｓｉｇｍａ产品）检测结果比较，结果无统计学差异，相关系数：γ＝０．９８。

柴胡提取物对人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度和细胞内VCR蓄积的影响

目的:测定中药柴胡(BupleurumChineseDC,BCDC)提取物对人肝癌BEL-7402细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)和长春新碱(Vincristine,VCR)浓度的影响,探索柴胡提取物逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制。方法:以Fura2/AM为细胞内钙离子的荧光指示剂,用双波长荧光分光光度计分别测定不同条件下的BEL7402细胞内[Ca2+]i。高效液相色谱法测定BCDC作用于BEL-7402后细胞内VCR蓄积情况的变化。结果:柴胡提取物可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降(P<0.001),可使细胞内VCR浓度升高(P<0.01)。结论:柴胡提取物可以增加VCR在BEL7402细胞内的积聚浓度,部分逆转BEL7402细胞的多药耐药(multidrugresistance,MDR)。钙离子通道阻滞作用可能为柴胡提取物逆转BEL7402细胞多药耐药的机制之一。

2型糖尿病患者血清对人脐静脉内皮细胞骨架及胞浆内游离钙的影响

目的探讨2型糖尿病患者血清干预人脐静脉内皮细胞(ECV-304)对细胞骨架微丝及胞浆内游离钙浓度的影响。方法ECV-304传代后取对数生长期细胞分为正常对照组(N组)、健康人血清干预组(H组)和糖尿病患者血清干预组(MD组)。按照1×105/ml将细胞种植在Pe-tri皿中进行分组干预,其中健康人血清、糖尿病患者血清浓度分别占总体积的10%。采用Fluo-3/AM作为荧光指示剂在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞内游离钙浓度的变化,采用荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞骨架微丝分布的差异。结果与N组比较MD组胞浆内荧光分布不均匀,胞浆内游离钙浓度显著升高,骨架微丝断裂,排列紊乱,少部分区域缺失。结论糖尿病患者血清干预正常的ECV-304可以造成内皮细胞的骨架结构改变,主要与细胞内游离钙浓度升高有关。

钙荧光探剂(Fura-2)在活细胞和线粒体钙利用中的应用

钙在细胞中起第二信使作用，用钙荧光探剂测量细胞和线粒体内游离钙浓度已成为一种越来越重要的技术。本文主要介绍用钙荧光探剂（Ｆｕｒａ－２）测量的原理、方法、应用及一些技术问题。

用Fura-2双波长荧光法测定小鼠海马细胞内游离钙

目的:探讨小鼠海马细胞分离及细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的测定。方法:低浓度胰蛋白酶消化、分离海马细胞,采用Ca2+荧光指示剂Fura2双波长荧光法测定[Ca2+]i。结果:海马细胞存活率超过95%。细胞外Ca2+1.0mmol/L时,静息状态下海马细胞[Ca2+]i为(210±10.7)nmol/L。30mmol/LKCl可显著增加[Ca2+]i,并且KCl的这种效应呈一定的剂量依赖关系。结论:低浓度胰蛋白酶消化分离小鼠海马细胞简单、可靠;Fura2建立的双波长荧光法灵敏、可靠。

中药柴胡提取物对人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度的影响

目的测定中药柴胡(Bupleurun Chinese DC, BCDC)提取物对人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响,以探索柴胡逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制.方法以Fura-2/AM为细胞内钙离子的荧光指示剂,用双波长荧光分光光度计分别测定不同条件下的BEL-7402细胞内[Ca2+]i.结果柴胡可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降(P<0.001).结论柴胡可使人肝癌细胞BEL-7402细胞内游离钙离子浓度下降,为一种钙离子通道阻滞剂(Calcium channel blocker, CCB),提示钙离子通道阻滞作用为柴胡逆转BEL-7402细胞多药耐药的机制之一.

应用Fura-2测定血小板内游离钙浓度

应用国产荧光指示剂Fura-2测定20名原发性高血压病人血小板内游离钙水平,结果血小板在静息状态下细胞内游离钙浓度为119.8±27.4nmol/L,批内变异为10.37％,批间变异为12.43％。

合成鱼腥草素对巨噬细胞呼吸爆发、细胞内游离钙离子浓度及T细胞分泌白细胞介素-2的影响

目的为了进一步分析合成鱼腥草素的免疫调节作用机理 ,研究合成鱼腥草素对于巨噬细胞呼吸爆发、细胞内钙离子浓度以及T细胞分泌白细胞介素水平的影响。方法巨噬细胞分离自大鼠腹腔灌洗液。以 2′ ,7′ 二氯荧光素二乙酯作为荧光指示剂 ,采用流式细胞术检测巨噬细胞的呼吸爆发。以fura 2作为钙离子荧光指示剂采用荧光分光光度法测定细胞内钙离子浓度。利用淋巴细胞分离液采用密度梯度离心法分离外周血T细胞 ,并用尼龙毛柱加以纯化。用ELISA法测定在亚适剂量ConA、白细胞介素 1α(IL 1α)以及白细胞介素 1β(IL 1β)存在的条件下合成鱼腥草素对白细胞介素 2 (IL 2 )分泌的影响。结果合成鱼腥草素可以刺激巨噬细胞呼吸爆发 ,提高细胞内钙离子浓度水平 ,促进T细胞分泌IL 2。结论合成鱼腥草素可能具有激活巨噬细胞和T淋巴细胞的作用 ,从而部分解释合成鱼腥草素的佐剂作用以及治疗感染性疾病的作用机理。

川芎嗪对大鼠心肌细胞膜钙通道的影响及其作用机制

目的:观察川芎嗪(L ig)对心肌细胞膜钙通道及胞内游离C a2+浓度([C a2+]i的影响,并探讨其作用机制。方法:急性分离大鼠心肌细胞,用特异性C a2+荧光探针F luo-3/AM负载细胞,激光共聚焦显微镜(LSCM)检测L ig作用后心肌细胞内[C a2+]i的变化。结果:L ig(30μm o l/L)可降低细胞内[C a2+]i;L-型钙通道阻断剂V erapam il(40μm o l/L)、1β受体特异阻断剂A teno lo l(900μm o l/L)和1α受体特异阻断剂Phen to lam ine(1×1-0 5m o l/L)预处理,均可不同程度地阻断L ig(30μm o l/L)对心肌细胞钙的作用;L ig(30μm o l/L)对1α受体特异激动剂Pheny lephrine(1×1-0 4m o l/L)、钙通道激动剂A 23187(900μm o l/L)和1β受体特异激动剂D obu tam ine(1×10-5m o l/L)引起的细胞内钙升高有抑制作用。不与血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体(AT1R)阻断剂V a lsartan位点作用。结论:L ig对心肌细胞内[C a2+]i的降低作用,是由细胞膜上的L-型钙离子通道、1α受体和1β受体介导的。

丹参对肝星状细胞胞浆游离钙的影响

目的 研究丹参药物血清对肝星状细胞 (HSCs)胞浆游离钙 ([Ca2 + ]i)的影响。方法 制备肝纤维化模型鼠。造模毕 ,药物组以每天 2 0 m l/ kg剂量分 2次灌服丹参 ,对照组灌以等量生理盐水。连续给药 6 d后经下腔静脉取血并分离血清。采用盲法 ,用上述 10 %药物血清培养 HSCs2 4 h,再将经药物血清预处理的细胞及对照组细胞负载 Fluo- 3/ AM后使用激光扫描共聚焦显微镜 (L SCM)检测 [Ca2 + ]i。结果 1正常丹参药物血清及肝纤维化药物血清预处理后均可明显减低活化的 HSCs的 [Ca2 + ]i,其荧光强度相对值与病理模型对照组的差异有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ;且两者与正常对照组的差异也有统计学意义 (P<0 .0 5 )。 2正常丹参药物血清预处理后加入血管紧张素 (Ang- ) ,[Ca2 + ]i荧光强度变化百分数显著低于病理模型对照组 (P<0 .0 5 ) ;肝纤维化药物血清组荧光强度变化百分数也显著低于病理模型对照组 (P<0 .0 5 )。结论 丹参能抑制肝星状细胞 [Ca2 + ]i的升高 ,可能是其发挥抗肝纤维化作用的重要途径之一。

小檗碱对豚鼠结肠平滑肌细胞内游离钙浓度的影响

采用Ca2 +荧光示踪剂Fura 2 AM和双波长荧光分光光度法 ,观察小檗碱 (berberine ,Ber)对酶法分离的豚鼠结肠平滑肌细胞内游离钙 ([Ca2 +]i)的影响并探讨其机制。在含 1 5mmol/LCaCl2 的HEPES Ringer缓冲液中 ,豚鼠结肠平滑肌细胞 [Ca2 +]i为 10 8± 9 4nmol/L (n =7) ,Ber对静息 [Ca2 +]i 无明显影响 ,Ber呈浓度依赖性抑制 ,6 0mmol/LKCl引起的 [Ca2 +]i 增高 ,IC50 值为 34 0 9μmol/L。在含 1 5mmol/LCa2 +和无Ca2 +的缓冲液中 ,30、10 0μmol/LBer均显著抑制 10 μmol/LACh所诱发的 [Ca2 +]i 的增高 ,且有浓度依赖性 ;同样Ber对环匹阿尼酸 (CPA)所致的 [Ca2 +]i 增高也有浓度依赖性抑制作用 ,有钙和无钙条件下IC50 分别为 37 97μmol/L和 49 70 μmol/L。结果提示 ,Ber对结肠平滑肌细胞外Ca2 +内流和细胞内钙释放均有抑制作用。

益肝康药物血清对大鼠肝星状细胞胞浆游离钙效应的抑制作用

目的研究益肝康药物血清是否具有抑制肝星状细胞(HSCs)胞浆游离钙([Ca2+]i)增高的作用。方法将32只健康雄性SD大鼠按随机数字表分为4组:肝纤维化模型益肝康组(8只)皮下注射用精制橄榄油配制的40%CCL4溶液9周,然后灌服益肝康6d;肝纤维化模型对照组(8只)皮下注射用精制橄榄油配制的40%CCL4溶液9周,然后灌服0·9%氯化钠溶液6d;正常大鼠益肝康组(8只)皮下注射等量精制橄榄油9周,然后灌服益肝康6d;正常对照组(8只)皮下注射等量精制橄榄油9周,然后灌服0·9%氯化钠溶液6d。结束后经下腔静脉取血并分离血清。用盲法,采用上述10%血清培养HSCs24h并负载好Fluo-3/AM后,使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测HSCs[Ca2+]i。结果(1)经正常大鼠益肝康组及肝纤维化模型益肝康组大鼠血清预处理的HSCs,其[Ca2+]i荧光强度相对值均明显低于肝纤维化模型对照组(P<0·05);且两者与正常对照组间差别均有显著性意义(P<0·05)。结论益肝康能抑制肝星状细胞[Ca2+]i的升高,这可能是其发挥抗肝纤维化作用的重要途径之一。

持续游泳运动对大鼠脑杏仁核神经细胞内钙离子的影响

目的:研究持续运动后大鼠杏仁核细胞内钙浓度的时程变化。方法:使用钙荧光指示剂Fura-2/AM负载大鼠脑杏仁核神经元细胞,用荧光双波长分光光度计比值法测定持续游泳运动后各时段及对照组的胞浆游离钙浓度。结果:当细胞外钙离子浓度为1.0 mmol/h,对照组钙离子浓度为362.12±24.30nmol/L,运动后即刻组钙离子浓度为388.23±17.40nmol/L,1h组钙离子浓度为89.70±14.50nmol/L,2h组钙离子浓度为278.31±15.20nmol/L,4h组钙离子浓度为322.26±19.30nmol/L。各组间数据存在显著差异(P<0.01)。结论:持续运动后大鼠脑杏仁核神经细胞内游离钙离子浓度总体呈先升后降,再升复常的时程变化。