猪FoxP3、IL-10双重实时荧光定量PCR方法建立及应用

旨在建立双重实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,对叉头框蛋白P3(FoxP3)、白细胞介素10(IL-10)的RNA转录进行定量检测。设计并合成FoxP3、IL-10的扩增引物和荧光探针,优化引物浓度、退火温度,建立RT-qPCR方法,检测猪圆环病毒2型(PCV2)感染外周血调节性T淋巴细胞(Treg)和免疫器官中FoxP3和IL-10的mRNA含量;根据Western blot检测蛋白表达验证方法的可靠性。结果:建立的RT-qPCR方法呈现“S”型扩增曲线,相关系数R^(2)≥0.99;转化生长因子-β(TGF-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素17(IL-17)等基因的核酸模板和阴性对照均无扩增曲线,最低检测浓度10 copies/μL,批内、批间变异系数分别为0.87%、1.84%;PCV2攻毒组外周血Treg细胞中FoxP3和IL-10的mRNA含量均出现明显升高,FoxP3的mRNA含量在攻毒第14天到达峰值,IL-10的mRNA含量在攻毒第10天到达峰值,PCV2感染后导致胸腺、淋巴结和脾脏中FoxP3和IL-10转录水平升高;Western blot检测表明,FoxP3蛋白表达量在攻毒第14天、第28天,IL-10在攻毒第10天和第14天显著高于对照组,与RT-qPCR结果一致。综上,本研究建立的猪FoxP3、IL-10双重RT-qPCR方法具有特异、敏感、检测稳定可靠的特点,对于评价猪体的免疫应答水平和机体免疫稳态具有重要意义。

鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立鸽圆环病毒(PiCV)的快速检测方法,依据PiCV Rep基因的保守序列区域设计了荧光定量PCR的引物和探针,并建立了快速检测PiCV的荧光定量PCR方法。结果显示,构建的PiCV荧光定量PCR方法在1.44×10,1~1.44×10^(7)/μL拷贝标准品间具有良好的线性关系,线性相关系数达0.9866;该方法具有良好的敏感性,其检测病毒系列含量下限为14.4拷贝/μL;该方法特异性良好,与鸽新城疫病毒、鸽疱疹病毒、鸽腺病毒等病毒及鸽组织DNA不存在交叉反应;该方法重复性较好,批内重复试验变异系数均介于0.454%~0.473%,批间重复试验变异系数均介于0.367%~0.869%。与传统普通PCR方法相比,所建立的PiCV荧光定量PCR方法敏感性更高,临床样品PiCV检出率更高,两者检测符合率为93.75%。结果表明,所建立的PiCV荧光定量PCR方法为临床检测鸽圆环病毒提供了一种快速、灵敏的检测方法,为PiCV的流行病学调查和主动监测提供了技术支撑。

犬冠状病毒和犬细小病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。针对CCoV的3′UTR与CPV的VP2设计引物与探针,通过对反应体系与条件进行优化,建立了CCoV与CPV的双重荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性、重复性验证与临床样品检验。结果:CCoV与CPV阳性参考质粒浓度在10^(2)~10^(7) copies/μL,CCoV与CPV的标准曲线R^(2)分别为0.999与0.996,线性关系良好,CCoV与CPV的最低检测限均为5 copies/μL,与其他病原无交叉反应,组内与组间的变异系数均小于1.38%,说明该方法灵敏度高、特异性强、重复性良好;对113份临床样本进行检测,与普通PCR比较,该方法对CCoV和CPV的检出率较高,分别为37.2%和40.7%。研究表明,本试验建立的CCoV和CPV双重荧光定量PCR方法检测效果良好,为相关疾病的临床诊断、流行病调查等提供了有力工具。

毛叶芋兰不同组织qRT-PCR内参基因选择与验证

毛叶芋兰(Nervilia plicata)是一种珍稀南药,目前对其有效成分及其分子调控机理鲜有报道。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)在植物基因表达分析中得到了广泛应用,但在毛叶芋兰中缺少研究,限制了相关工作的开展。在前期工作基础上,本研究从毛叶芋兰转录组数据库中筛选出Actin、GAPDH、TUA、UBC、UBQ、EF-1α、EF-1β、CYP、RPL共9个常见管家基因,以毛叶芋兰叶片、叶柄和球茎3个组织部位为材料,开展qRT-PCR内参基因的筛选工作。经过9个基因在不同组织的表达水平、稳定性和综合分析,筛选出最适合的内参基因,并选择毛叶芋兰花青素合成途径关键基因NpDFR、Np3GT进行验证。结果发现:EF-1α和CYP的表达稳定性相近,整体稳定性最好。2个内参基因单独或共同使用时,NpDFR、Np3GT在不同组织的表达情况与转录组测序结果基本一致,表明其均可用作qRT-PCR的内参基因。本研究结果为进一步开展毛叶芋兰药效相关基因的分子作用机理研究提供依据。

鸽圆环病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为实现对鸽圆环病毒(pigeon circovirus, PiCV)的快速检测,建立了针对Cap基因的PiCV荧光定量PCR检测方法,并应用该方法进行PiCV分子流行病学调查。本研究针对PiCV核衣壳蛋白Cap基因的保守序列设计一对特异性引物,并通过优化反应条件,成功建立了荧光定量PCR检测方法。此外,还对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行了全面评估。利用建立的荧光定量PCR方法对华北和西北部分地区147份临床样本进行检测,并对阳性代表样本的Cap全长序列进行遗传演化分析。结果表明,所建立的荧光定量PCR方法在1×10^(4)至1×10^(8)拷贝·μL^(-1)范围内显示出良好的线性关系,最低检测限达到1×10^(1)拷贝·μL^(-1),显著高于传统PCR方法。此方法具有良好的重复性,且不与其他常见鸽病病原产生交叉反应。采用本试验方法检测的147份华北和西北部分地区肉鸽和信鸽临床样本PiCV阳性率为85.0%,阳性样本的Cap全长序列分析及遗传演化分析结果显示,6株分离株相似性在89.8%~97.5%之间,与PiCV HeBeiTS2021株在同一个分支,亲缘关系较近。建立的PiCV荧光定量PCR方法具备灵敏、特异和稳定等优点,可用于PiCV的快速检测,同时流行病学调查结果表明,2022—2023年华北和西北部分地区PiCV感染率较高,为我国PiCV的防控研究提供数据支撑。

兔源支气管败血波氏杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立兔源支气管败血波氏杆菌(Bb)的快速检测方法,用于兔波氏杆菌病的诊断。【方法】以Bb的fimX基因为靶基因,设计特异性引物并构建质粒标准品。在此基础上建立检测兔源Bb的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评价,并将该方法初步应用于临床样品的检测。【结果】荧光定量PCR方法仅对兔源Bb的检测结果呈阳性,对其他常见兔源病原菌的检测结果均呈阴性;对质粒标准品的最低检测限为13.8拷贝·μL^(-1),敏感性是普通PCR方法的10倍;批内重复性试验的变异系数小于2%,批间重复性试验的变异系数小于3%;对68份临床样品进行检测,阳性检出率为39.71%,比普通PCR方法的高2.95%。【结论】建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,且对临床样品的阳性检出率比普通PCR方法高,为兔源Bb的快速检测和防控提供了技术支持。

发酵乳中活性益生菌三重数字PCR定量检测方法的建立

益生菌发酵乳是益生菌市场发展的重要赛道,精确定量产品中活性益生菌对保障其营养功能至关重要。文章以嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)和动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)为研究对象,采用种特异性引物和探针,结合叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)染色,基于芯片式数字PCR技术建立了发酵乳中活性益生菌的三重定量检测方法。结果表明,3组引物和探针均能特异性扩增目标菌株,无交叉反应,且20μg/mL的PMA能够有效抑制嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌死菌DNA的扩增。该检测方法对嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌的灵敏度分别为1.65、2.20、2.16 copies/μL,重复性检测的相对标准偏差为1.52%~8.69%,成功实现了对发酵乳中3种常见益生菌的活菌定量检测。为益生菌发酵乳中活菌检测的标准化提供了技术支持和科学依据。

奶牛乳房炎5种致病菌多重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种能快速检测奶牛乳房炎主要病原菌(大肠埃希氏菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌)的多重PCR检测方法,根据大肠埃希氏菌phoA基因、无乳链球菌ef-tu基因、肺炎克雷伯氏菌Khe基因、金黄色葡萄球菌Nuc基因和肠炎沙门氏菌invA基因设计特异性引物,优化PCR反应体系与反应程序并进行特异性试验,同时分别构建含病原菌基因的pMD-19T重组质粒进行灵敏性试验。结果显示,多重PCR反应的最适引物工作浓度为0.8μmol/L,最适退火温度为59.6℃,最佳延伸时间为40 s,最合适的循环数为30次;优化后的多重PCR反应体系可扩增出5种目标病原菌的特异性条带;5种病原菌PCR检测灵敏度可达到5 copies/μL。进一步利用该多重PCR反应体系对采集的108份乳房炎乳样进行检测,检测结果显示,108份样本的阳性检出率为77.8%,大肠埃希氏菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和肠炎沙门氏菌的检出率分别为23.1%、8.3%、34.3%、8.3%、5.6%。结果表明,建立了一种具有良好特异性和灵敏性的多重PCR检测方法,在临床生产实践中可用于快速鉴定奶牛乳房炎的致病菌,为奶牛乳房炎的诊断、防控与流行病学调查提供了方法基础。

三疣梭子蟹附肢再生过程中qRT-PCR内参基因的筛选与Wnt7b表达研究应用

为筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)附肢再生过程中的最适内参基因,以附肢再生不同阶段的三疣梭子蟹为研究对象,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对细胞骨架蛋白基因(β-actin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)、18S rRNA(18S)、转录延伸因子基因(EF1α)、核糖体蛋白L18基因(RPL18)、细胞色素C氧化酶基因(COX)和组蛋白基因(HIS)共7个候选内参基因在肌肉、眼柄、血淋巴、肝胰腺、鳃、心脏和再生附肢共7种组织中的表达水平进行检测,并利用△Ct、geNorm、NormFinder和BestKeeper程序对候选内参基因的稳定性进行评价,筛选出合适的内参,最后以最适内参基因作为参考,分析再生相关基因Wnt7b的表达水平。结果显示,在不同组织中综合稳定性最好的是RPL18,而在不同再生阶段的再生附肢中β-actin和RPL18基因做双内参基因更适合。以RPL18和β-actin作双内参基因研究Wnt7b的表达水平时发现,Wnt7b基因在三疣梭子蟹附肢再生过程中的表达呈先上升后下降再上升的趋势;Wnt7b基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达,除再生附肢和血淋巴外其他组织中的表达量都较低。本研究结果为甲壳类再生发育相关研究内参基因的选择及分子调控机制研究提供了参考。

荧光定量PCR(qPCR)检测“漂浮型”浒苔微观繁殖体

浒苔绿潮是我国南黄海海域最严重的生态灾害。浒苔微观繁殖体的时空分布、种群动态,是黄海浒苔绿潮业务化监测工作的重要内容,但传统的培养法实验周期长、检测效率低,无法满足快速监测预警的要求。本文利用297 bp的漂浮浒苔特异性DNA片段,研发了浒苔微观繁殖体的荧光定量PCR(qPCR)检测技术,并以人工释放的浒苔配子为研究对象,研究了浒苔配子细胞中目标基因片段的拷贝数(240 copies/cell)。利用qPCR法对2023年4月苏北浅滩海域水样进行检测,并与传统培养法进行比较。结果显示,黄海大规模浒苔绿潮暴发前期,苏北浅滩水体中浒苔微观繁殖体丰度为2.1×10^(7) copies/L(约87602 cells/L,qPCR)和6.5株/L(传统培养法),且呈现近岸(靠近筏架区)高、离岸低的趋势。两种方法对浒苔微观繁殖体的检出效率和揭示的分布规律基本一致。qPCR法灵敏、高效,可用于黄海浒苔绿潮业务化监测工作。

巴尔通体巢式PCR检测方法的建立与应用

为建立一种应用于巴尔通体(Bartonella)高灵敏度、高特异性的检测方法,根据巴尔通体16S保守序列设计特异性引物,通过优化反应体系及反应条件,建立巢式PCR检测方法,并利用该方法对在2023年广州市花都区采集的100份褐家鼠脾脏样品进行检测。结果显示:所建立的巢式PCR方法特异性良好,可特异性检测出巴尔通体阳性核酸,与其他对照菌株贝氏柯克斯体、无形体、钩端螺旋体、立克次体和伯氏螺旋体阳性核酸均无交叉反应;该方法灵敏度高,最低检出限为7.66×10^(1)copies·μL^(-1);应用该方法完成100份临床样品快速检测,检出4种巴尔通体,其中1种与人类疾病有关。表明建立的巴尔通体巢式PCR检测方法特异性强、灵敏度高,可为巴尔通体的临床样品检测提供技术支持。

小麦叶疫病菌实时荧光PCR检测方法的建立

为了快速准确地鉴定小麦叶疫病菌(Alternaria triticina),根据小麦叶疫病菌基因组序列中保守区域设计特异引物AT-F6/AT-R5和探针AT-P5,建立小麦叶疫病菌实时荧光PCR检测方法。引物AT-F6/AT-R5和探针AT-P5能特异性地扩增阳性小麦叶疫病菌DNA,其他供试菌株均不能扩增。建立的实时荧光PCR检测方法检测灵敏度可达600 fg菌体DNA。该方法可以有效快速地对小麦叶疫病菌进行检测,为口岸进境麦类产品中病菌检测和疫情监测提供技术支撑。

4种食源性致病菌多重PCR检测体系的建立及其在乳品检测中的应用

食源性致病菌是通过食物进入人体引起食物中毒和诱发疾病的有害微生物,严重威胁着人类健康和环境安全,为了预防和控制食源性疾病的发生,有效对策之一是对食品中的病原微生物进行安全检测。本研究采用一种多重聚合酶链式反应法(multiplex polymerase chain reaction,MPCR)快速检测乳品中4种食源性致病菌,结果表明,选取单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因、蜡样芽胞杆菌gyrB基因、鼠伤寒沙门氏菌invA基因、大肠埃希氏菌O157∶H7 stx2A基因的保守序列设计4对引物,在优化的PCR反应体系和退火温度58℃下,PCR扩增表现出良好的特异性,分别扩增出274、221、482、108 bp条带,无非特异性扩增,4种病原菌检出限达到10~100 CFU/mL;对17份人工染菌牛奶样品进行检测,检出结果与国标培养法完全一致。该研究结果为快速、高效、准确地检测出乳品中单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7提供了一种实用方法,也为其他食源性致病菌的快速检测提供了思路。

尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。

TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌

建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。

绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法的建立与应用

[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

实时定量PCR应用于研讨式分组实验教学实践

实时定量PCR作为一项生命科学及其相关领域的重要技术,已成为高校生物实验教学中不可或缺的知识内容。以分子生物学实验基础教学内容为依托,围绕实时定量PCR技术面向本科生开设了综合性实验。在充分考虑学生的理论和操作水平以及本科实验教学特点的基础上,对实验设计和实验方法进行了优化,并采取研讨式分组教学模式,提高教学效率与教学质量的同时,更突出了学生在实验教学中的主体地位,有助于培养学生的科学思维、科学素养以及综合实践能力。

五种烟草根茎病害病原菌多重PCR检测方法的建立与应用

为了快速准确鉴别烟草根腐病菌(Fusarium oxysporum)、黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)、立枯病菌(Rhizoctonia solani)、根黑腐病菌(Thielaviopsis basicola)和鸢尾丝囊霉菌(Aphanomyces iridis)等5种烟草根茎病害病原菌,利用RAPD分子标记等方法筛选和设计特异性扩增引物,优化多重PCR扩增体系中各引物添加量、退火温度、循环数等条件,建立多重PCR检测体系,并对其检测的可行性进行验证。本研究筛选并设计出F.oxysporum、P.nicotianae、R.solani、T.basicola和A.iridis的特异性引物对LD141 F/R、YM1002 F/R、LK111 F/R、GHFT F/R、AiT7 F/R,PCR反应体系中最佳引物组合浓度分别为1.0、1.0、0.2、0.5、0.5μmol/L,最适退火温度为54℃,最佳循环数为28,可同时扩增出大小分别为370、240、536、783、138 bp的特异性片段,能同时检出5种病原菌DNA的最低限值为0.5 ng/μL,可实现对烟草育苗基质和烟株中5种病原菌的快速检测,对烟草苗期根茎病害的早期预防具有重要意义。

荧光定量PCR技术在产前诊断中的应用效果

目的探讨荧光定量PCR(QF-PCR)技术联合染色体核型分析在产前诊断中的应用效果。方法选取2022年9月至2023年5月于惠州市第二妇幼保健院产前诊断中心行羊水穿刺检查的388例孕中期孕妇为研究对象,所有入选者均进行染色体核型分析、QF-PCR技术检查。以染色体核型分析为标准,分析QF-PCR技术在产前诊断中的应用价值。结果388例受检羊水中,QF-PCR检测出其中1例母血污染。388例受检者中QF-PCR共检出17例染色体非整倍体异常,包括21三体异常10例,18三体异常2例,13三体异常1例,性染色体异常4例。与染色体核型分析结果相符,染色体核型分析结构异常13例,QF-PCR技术均未检出。结论QF-PCR技术能鉴别母血污染以及检查快速,可弥补染色体核型分析时间长的不足;而染色体核型分析可补充QF-PCR技术对其他染色体异常检测的不足,两种方法联合使用可起互补作用,利于减少出生缺陷。

笋用林3种竹笋夜蛾多重PCR鉴定技术的建立与应用

【目的】建立鉴定竹笋夜蛾物种的多重PCR技术,用于浙江省笋用竹的3种竹笋夜蛾幼虫的物种鉴定。【方法】针对COI基因的变异区设计物种特异性多重PCR引物;优化影响多重PCR反应的参数,建立鉴定竹笋夜蛾的多重PCR技术;采用标准DNA模板评价多重PCR技术的敏感性和特异性;利用多重PCR技术对林间采集的竹笋夜蛾幼虫进行物种鉴定。【结果】针对3种竹笋夜蛾COI基因的变异区设计了3条物种特异性多重PCR引物,与通用引物LCO1490配合使用,扩增竹笋基夜蛾、竹笋禾夜蛾和笋秀夜蛾COI基因片段,大小分别为290、390和590 bp。优化后的多重PCR鉴定技术的反应体系为:2×HotStart Taq PCR预混试剂10μL,10μmol·L^(-1)的引物LCO1490、JYE290、HYE390和QTYE590各0.5μL,DNA模板1μL,加ddH2O补足20μL。优化后的多重PCR鉴定技术的反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸30 s;72℃下延伸10 min,循环数为35。多重PCR鉴定技术对笋秀夜蛾的最低检出限为0.01 ng·μL^(-1),对竹笋禾夜蛾和竹笋基夜蛾的最低检出限低于0.001 ng·μL^(-1)。林间样品鉴定结果表明,所有38份DNA都能扩增出明显的特异性条带,鉴定成功率100%;经测序验证,本研究的技术鉴定的物种与经COI基因序列鉴定的物种一致。【结论】研究建立了浙江省笋用竹的夜蛾的多重PCR鉴定技术,能够快速高效鉴定浙江省笋用林内竹笋夜蛾幼虫的物种,该技术具有鉴定周期短、灵敏度高、特异性强、准确度高等优点。