膜分离耦合离子交换层析制备高纯度α-乳白蛋白

以生牛乳为原料,经膜分离及喷雾干燥制得鲜乳乳清蛋白粉,结合离子交换层析制备高纯度α-乳白蛋白。结果表明:在浓缩3倍、微滤1次、洗滤2次的膜分离条件下,50 nm陶瓷膜渗透液中α-乳白蛋白占真蛋白的21.04%,高于100 nm陶瓷膜渗透液(15.84%);对50 nm陶瓷膜渗透液进行喷雾干燥,并进行离子交换层析,层析时,在10倍柱体积内,Na Cl溶液浓度由0 mol/L增至0.5 mol/L,α-乳白蛋白与β-乳球蛋白能较好地分离,得到的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白纯度分别为98.18%和97.82%。本研究结果可为工业化制备高纯度α-乳白蛋白乳基料提供技术支持。

"Click chemistry" preparation of WCX packings for protein separation

Click chemistry was applied to immobilize three kinds of alkyne-carboxylic acids onto azide-modified silica gel to prepare three novel stationary phases for weak cation exchange chromatography（WCX）.The developed protocol combines the benefits of operational simplicity,exceptionally mild conditions and high surface loadings.Six kinds of standard proteins were separated completely on the novel packings.Compared with commercial WCX columns,the three kinds of novel WCX packings prepared by click chemistry approach have better resolution and selectivity.Lysozyme was purified successfully from egg white with the novel WCX column by one step.The purity was more than 97%and a high specific activity was achieved to be 81,435 U/mg.The results illustrate the potential of click chemistry for preparation of stationary phase for IEC.

“Grafting from”法制备高载量大孔弱阳离子交换层析介质

针对大孔聚合物层析介质孔径大、比表面积低而导致的蛋白结合容量低的问题,采用“graftingfrom”策略,以大孔聚丙烯酸酯微球为基质,通过氧化还原引发甲基丙烯酸在微球表面接枝聚合,制备了高载量弱阳离子交换层析介质.研究了单体浓度、过硫酸钾浓度及反应温度等因素对蛋白结合容量的影响.所得介质的蛋白静态结合容量和动态结合容量分别达到252.21和157.25mg/mL;同时发现具有一定离子交换容量的该类介质能够在0.2 mol/L NaCl缓冲液中保持100 mg/mL的蛋白结合容量.将该层析介质用于鸡卵清中溶菌酶的纯化,获得了较高的纯化效率.

他克莫司的分离提纯研究

目的 开发一种他克莫司的分离提纯工艺。方法 采用离子交换树脂脱色除杂、纳滤、结晶等手段得到高质量的他克莫司粗粉,再经反相色谱硅胶层析、复合溶液结晶,得到符合USP标准的他克莫司精粉。结果 优选的脱色树脂为D002,所得他克莫司粗粉效价大于800μg/mg,二氢他克莫司含量小于4%;该粗粉经UniSil C8Ultra Plus层析纯化,精粉含量大于99.5%,最大单杂小于0.1%。结论 该工艺操作简单、能耗低、收率高,适于他克莫司的产业化应用。

猪皮胶原蛋白抗氧化肽的分离纯化及体外抗氧化活性研究

采用碱性蛋白酶对猪皮胶原蛋白进行酶解，制备抗氧化肽。为了得到抗氧化活性高且纯度高的抗氧化肽，本实验采用多种体外抗氧化评价体系研究超滤获得的各分子质量段猪皮胶原蛋白抗氧化肽的体外抗氧化活性；依次采用离子交换色谱、凝胶色谱对猪皮胶原蛋白酶解液进行分离纯化。结果显示：超滤分离获得5～10ku的抗氧化肽较其他分子量范围的抗氧化肽具有较好的抗氧化活性；采用离子交换色谱、凝胶色谱两种分离方法分步分离能达到较好的分离纯化效果，离子交换色谱分离得到7个组分，其中组分P1对O2-·清除率最高，多肽浓度为0．85mg／mL时，清除率为46．30％，IC50值为1．24mg／mL；该组分经过凝胶色谱分离后得到2个组分，其中组分P1-B对O2-·清除率最高，多肽浓度为0．9mg／mL时，清除率为49．43％，IC50值为0．98mg／mL。

大孔吸附树脂法及离子交换层析柱法精制纯化丹参多糖的研究

目的:对中药丹参中多糖成分进行提取、分离、精制和纯化研究。方法:丹参药材经过水提醇沉得到粗多糖(SMP)。采用大孔树脂法及离子交换层析柱法精制纯化粗多糖,综合比较D-101、AB-8、DB-301及MG-1等4种大孔吸附树脂对粗多糖的分离纯化效果,进一步以DEAE-52离子交换层析法对过AB-8柱制备得到的粗多糖进行分离精制。结果:粗多糖中总多糖含量为40.35%,蛋白质含量为8.96%,经4种大孔树脂初步纯化后发现AB-8、DB-301型的树脂效率高,纯化后多糖含量分别可达78.72%、80.45%。总多糖经DEAE-52离子交换树脂进一步分离得到SMP1、SMP2、SMP3三个组分。结论:AB-8、DB-301型大孔吸附树脂及DEAE-52型树脂可应用于丹参多糖的精制纯化。

超大孔离子交换制备色谱分离纯化高活性凝血因子Ⅷ

建立了一条从人血浆中分离高活性凝血因子Ⅷ(FⅧ)的纯化工艺。基于FⅧ和介质孔径的尺度比及其对蛋白质活性影响的分析,设计了以超大孔离子交换制备色谱为核心步骤的新型分离纯化工艺。分别进行超大孔离子交换色谱与传统离子交换色谱的条件优化,并对优化工艺所得产品进行了活性检测(底物显色法)和纯度检测(高效凝胶过滤和凝胶电泳)。结果表明,超大孔介质结构不但可以有效地保护蛋白质大分子结构,而且能够大幅度地提高制备色谱的传质速率,从而得到具有高凝血活性的FⅧ产品。FⅧ在超大孔制备色谱过程中的回收率(85%)比传统离子交换制备色谱高4～5倍,产品比活高达154 IU/mg。此外,还研究了超大孔介质的再生程序,采用5个柱体积的1 mol/L NaOH低流速清洗色谱柱,保证了色谱工艺的稳定性。本纯化工艺步骤简单,重现性好,易于放大生产。

离子交换纤维柱分离纯化辣椒碱类化合物

考察了ZB-2强碱性阴离子交换纤维柱分离纯化指天椒中的辣椒碱类化合物。通过对离子交换纤维吸附前后扫描电镜图分析,表明吸附上了物质,并由红外光谱图分析证实所吸附的物质为辣椒碱类化合物。考察了上柱液pH、质量浓度、流速、上样量与离子交换纤维吸附量的关系,讨论了解吸条件中乙醇体积分数、流速、用量与离子交换纤维解吸率的关系,确定了离子交换纤维柱分离纯化的最佳工艺参数,得到在该条件下辣椒碱类化合物的质量分数由4.5%提高到92.0%,同时收率达72.3%。结果表明,离子交换纤维柱能快速分离纯化辣椒碱类化合物。

阴离子交换整体柱对蛋白质的分离与纯化

分别用乙二胺、二乙胺、三乙胺将自制的以甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)为交联剂的整体柱修饰为弱、强阴离子交换整体柱。考察了该整体柱的性能,选择出分离蛋白质(牛血清白蛋白、溶菌酶和谷胱甘肽)的最佳实验条件,并在最佳分离条件下考察了这些蛋白质在整体柱上的色谱行为和该整体柱对纤维素降解酶的分离纯化情况。实验结果表明,该整体柱性能良好,可以实现对纤维素降解酶的快速分离与纯化。同时,实验也证明采用梯度洗脱可以实现对某些蛋白质的分离纯化。

乳清蛋白肽的酶法制备、分离纯化及活性评价

以抗氧化活性及蛋白质回收率为筛选指标对乳清蛋白肽酶解工艺进行优化,用层析柱对酶解液进行逐级分离纯化,并对其分子质量进行检测.研究结果表明:利用胰酶、复合风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解制备乳清蛋白肽,最佳用酶为碱性蛋白酶、最适底物含量为4.0%、最适加酶量为8000U/g、最佳酶解时间为4h;酶解液经DEAE-52纤维素层析后得到的A组分抗氧化活性最好,其还原力为0.320 0±0.004 1,DPPH自由基清除率为6.58%±0.36%;A组分再经Sephadex G-15葡聚糖凝胶层析柱分离纯化后得到组分G,其DPPH自由基清除率为6.73%±0.083%;组分G的主要成分为分子质量378 u的肽段,其一级氨基酸组成为赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)及丝氨酸(Ser).

大米镉结合蛋白的分离纯化及纯度鉴定

采用石墨炉原子吸收光谱法(graphite furnace atomic absorption spectrometry,GFAAS)测定不同品种、不同加工精度大米及大米4种蛋白质中的镉含量。选用镉含量较高的大米为实验原料,采用Osborne分级法提取大米中的4种蛋白质(清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白),以及超滤、离子交换色谱从镉含量较高的大米蛋白中分离纯化出均一纯度的大米镉结合蛋白(rice Cd-binding protein,RCBP),十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定RCBP的纯度及测定分子质量。结果表明:籼米中镉含量高于糯米及粳米;随着加工精度的增加,同种大米中的镉含量依次降低。4种大米蛋白中的镉含量分别为0.66、0.31、0.63、0.23μg/g,清蛋白中镉含量最高。超滤分离大米清蛋白(rice albumin,RA)得到大米超滤清蛋白(rice ultrafiltration albumin,RUA),离子交换色谱纯化RUA得到目标镉结合蛋白(组分c),SDS-PAGE鉴定组分c为单一条带,分子质量为14 k D。

孔石莼(Ulva pertusa)中一种抗TMV活性蛋白的纯化及其特性(英文)

采用硫酸铵盐析和阳离子交换柱层析(CM—Sepharose Fast Flow)，从孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)藻体中分离纯化得到1个蛋白，命名为UPCM40。经SDS—PAGE确定其分子量约为36kD，Native—PAGE可知其为单一组分；该蛋白不含糖；其全波长扫描结果显示，该蛋白在190～220nm和250～300nm处有特征吸收峰，在250～300nm范围中的最大吸收峰在270～275nm处。经测定发现该蛋白具较好的抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的活性，当蛋白质浓度为50μg/mL时，对TMV的抑制效果为：在枯斑寄主心叶烟上的侵染抑制率达85．6％，在苋色藜上为90．2％。测定该蛋白对6种供试真菌的抑制效果发现，对镰刀菌(Fusarium oxysporum f．sp．cucumerinum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和香蕉炭疽菌(Gloeosporium musarum)均有一定程度的抑菌作用，但抑制活性很低。

金枪鱼皮胶原蛋白肽分离纯化工艺的研究

采用超滤法、凝胶层析柱法、离子交换法、高效液相分析法等研究金枪鱼皮胶原蛋白肽(TSCP)的分离纯化工艺。结果表明:通过超滤分离分子量越低TSCP组分DPPH·自由基、·OH自由基、超氧阴离子清除率越高,且分子量小于3kDa的TSCP-IV组分的清除率最高,IC50值分别为0.17,0.20,1.64mg/mL。对TSCP-IV进行Sephadex G-25凝胶柱过滤层析后得到4个峰,峰GP-I的得率较高,且峰GP-I对DPPH·自由基、·OH自由基、超氧阴离子的清除率较高,IC50值分别为50.01,86.56,623.75μg/mL。将凝胶过滤组分GP-I经离子交换柱用不同pH值溶液梯度洗脱后得到4个峰,pH 5.61时的洗脱峰IP-II的得率较高,且IP-II对DPPH·自由基、·OH自由基、超氧阴离子清除率较高,IC50值分别为21.59,20.28,121.23μg/mL。用高效液相色谱分析表明,IP-II为纯度较高的金枪鱼皮胶原抗氧化肽段。

蛋白质层析系统在实验教学中的应用

设计"KTAprime plus蛋白质层析系统纯化绿色荧光蛋白(GFP)"的综合实验,以GFP蛋白为研究对象,在大肠杆菌中大量表达重组GFP蛋白,经镍柱亲和层析、离子交换层析以及凝胶过滤层析3种常用层析技术逐步纯化,各步纯化样品经SDS-PAGE鉴定分析,最终获得高纯度的GFP蛋白。通过该实验使学生深入、全面、系统地掌握生命科学研究中最新的蛋白质分离纯化技术,提高学生的科研水平和综合能力。

新型离子交换柱分离蛋白质类药物的研究

为了更好的优化蛋白质类药物的纯化工艺 ,对溶菌酶、细胞色素C、碱性成纤维细胞生长因子 3种药物在新型离子交换柱ResourceS上的色谱行为进行了研究 ,考察了pH值、盐类型及流速对蛋白质保留体积和分离度的影响。结果表明 :缓冲液 pH值的升高使蛋白质保留体积减少 ;洗脱速度的提高使蛋白质的分离度降低 ;盐的类型对蛋白质分离度影响没有规律。

层析法分离纯化纳豆激酶的技术参数研究

采用柱层析技术对盐析后的纳豆激酶发酵液进行分离纯化,以确定层析分离纳豆激酶的技术参数。对比了Sephadex G-50及Sephadex G-7凝胶层析分离纳豆激酶的效果,并进行了不同pH值条件下的层析效果分析。结果表明,在pH值为6.4时,经Sephadex G-75凝胶层析及SP Sepharose FF离子交换层析后,能够得到较高纯度的纳豆激酶,使纳豆激酶纯化了9.2倍,回收率为51.5%。SDS-PAGE电泳显示所得纳豆激酶为单一蛋白带,其分子质量为28ku。

弱阳离子交换色谱中疏水作用对蛋白保留的影响

选取了四种常用的弱阳离子交换(WCX)商品柱以研究标准蛋白在其上的色谱保留行为。发现在疏水色谱(HIC)模式下,蛋白在这四种WCX商品柱上也有不同程度的保留特征,且洗脱曲线呈现出保留值随盐浓度变化的"U"型。从分子力学角度定性解释了因疏水相互作用力的存在影响了蛋白在WCX色谱柱上洗脱顺序的改变。运用计量置换理论(SDT)中的两组线性方程进一步证实了WCX和HIC中蛋白与固定相间相互作用力的性质,在HIC中为非选择性作用力,而在离子交换色谱(IEC)中为选择性作用力。这四种色谱柱中的两种事实上可在WCX和HIC两种模式下,对标准蛋白进行分离且有较好的分离效果,有可能作为二维色谱柱来使用。

猪血凝血酶的分离与纯化

报道了以猪血为材料制备凝血酶的新方法:先将猪血浆在-20℃条件下冷冻2d,离心除去纤维蛋白原,再等电点沉淀,得凝血酶原,经CaCl_2激活后,通过DEAE—SepHarose FastFlow离子交换柱层析纯化,获得比活为1807.9U/mg的电泳纯凝血酶制剂,其收率为48.9％。该方法生产工艺简单,所得产品纯度高,对凝血酶的生产具有一定的指导价值。

离子交换层析法分离纯化玉米降血压肽的研究

以玉米蛋白为原料酶解得到了具有降血压活性酶解液,为了得到高活性、高纯度的降血压肽,采用离子交换层析法对酶解液进行了分离纯化。主要研究了离子强度、离子强度梯度以及上样量对分离效果的影响,得到最佳条件:NaCl强度为2mol/L;离子强度梯度为0.024mol/L·min;最大上样量为300mg。在此条件下分离得到的组分,其抑制ACE活性达到90%,含量为25g/100g。

重组人瘦素蛋白纯化鉴定及其单克隆抗体制备

大肠杆菌(E.coli)重组表达获得的重组人瘦素蛋白(rh-leptin),复性、纯化后进行SDS-PAGE电泳和Western-blot印迹杂交鉴定其免疫学活性,免疫小鼠后制备单克隆抗体,结果表明通过对rh-leptin进行复性和纯化,获得了高纯度的具有免疫学活性的rh-leptin蛋白,并获得一株稳定分泌抗rh-leptin单抗的杂交瘤细胞株。瘦素蛋白的纯化及其单克隆抗体的制备,可供瘦素进一步研究应用。