志贺氏菌福氏2a 301株ipaH4.5突变株的构建及生物学功能分析

利用λ-Red重组系统对福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因进行缺失突变,构建了福氏2a志贺氏菌301株ipaH4.5基因缺失突变株?ipaH4.5,利用低拷贝质粒构建ipaH4.5缺失突变株的回复突变株△ipaH4.5HF。PCR方法证实了ipaH4.5基因的缺失和回复。对野生株、突变株和回复突变株的生长代谢及细胞侵袭能力进行比较;ELISA方法检测3株菌侵袭鼠J774巨噬细胞后培养上清中炎性因子的水平。生长代谢实验表明缺失和回复ipaH4.5不影响志贺氏菌的生长速度,侵袭实验表明缺失和回复ipaH4.5也不影响志贺氏菌对HeLa细胞和鼠J774巨噬细胞的侵袭能力,表明ipaH4.5基因与志贺氏菌的生长代谢和侵袭能力无关;鼠J774巨噬细胞培养上清中细胞因子水平的改变提示该基因在志贺氏菌侵入细胞后抑制宿主细胞炎症反应。

痢疾杆菌GST-IpaH4.5载体构建及其在大肠杆菌中的表达

目的构建痢疾杆菌GST-IpaH4.5融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌(E.coli)中诱导表达。方法以痢疾杆菌福氏2a 301株全基因组为模板,PCR扩增痢疾杆菌ipaH4.5基因,在ipaH4.5的上游加上BamHⅠ酶切位点,下游加上XholⅠ酶切位点,将ipaH4.5基因定向插入质粒pGEX-4T-1中,构建原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并转化E.coliDH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶切鉴定和DNA序列测定,DNA序列正确后提取质粒转化E.coli BL21,筛选阳性转化子,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达结果。结果成功构建IpaH4.5原核表达质粒pGEX-IpaH4.5并表达出大小约86 000Mr的GST-IpaH4.5融合蛋白。结论 GST-IpaH4.5融合表达载体的构建,为进一步纯化IpaH4.5蛋白和研究其在痢疾杆菌致病机制中的作用奠定了基础。

福氏志贺菌Ⅲ型分泌系统效应子IpaH4．5功能的初步研究

目的:IpaH家族是福氏志贺菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)效应子的成员,但功能不清,特别是对IpaH4.5的研究未见报道。本研究拟探讨IpaH4.5的功能。方法:克隆了福氏志贺菌2a 301株的IpaH4.5基因,构建了带Flag和GFP标签的IpaH4.5真核表达载体。通过Western印迹和共聚焦确定IpaH4.5在真核细胞293T中的表达和定位,通过报道基因的方法观察IpaH4.5对宿主细胞NF-κB途径的影响。结果:Western印迹证实IpaH4.5在真核细胞中有表达,激光共聚焦确定IpaH4.5在真核细胞中定位于细胞膜和细胞核,通过报道基因观察到它可以抑制宿主细胞的NF-κB途径。结论:发现IpaH4.5可以抑制NF-κB途径,为进一步研究IpaH4.5的功能奠定了基础。