铁硫簇结合蛋白1的磁感应能力

目的探究铁硫簇结合蛋白1(ISCA1)磁场刺激后对细胞钙内流的影响。方法(1)制备携带ISCA1基因的质粒、携带Magneto 2.0序列的质粒和空载质粒,且3种质粒均携带mCherry基因,包装成慢病毒感染HEK293A细胞,荧光显微镜观察慢病毒感染效率。(2)免疫共沉淀技术检测ISCA1与隐花色素1(CRY1)和CRY2蛋白之间的结合。(3)在磁场(40 mT,0.1 Hz,90%占空比)条件下,活细胞钙成像技术检测高表达ISCA1或Magneto 2.0细胞的钙内流。结果(1)在HEK293A细胞中观察到红色荧光,表明慢病毒转染成功。(2)外源ISCA1蛋白与内源CRY1或CRY2蛋白不结合。(3)与加磁前相比,加磁后Magneto 2.0组细胞的绿色荧光强度增加(1.8±0.5)倍(P<0.05),即发生显著的钙内流;而ISCA1组及细胞对照组细胞的绿色荧光强度与加磁前相比无显著差异。结论外源高表达ISCA1的细胞在此磁场条件刺激后未引起细胞钙内流,无明显磁感应性。

铁硫簇的结构、功能及生物合成研究进展

铁硫簇是普遍存在于生物体中的最古老的生命物质之一。铁硫簇基本结构单元有[2Fe-2S]、[3Fe-4S]、[4Fe-4S]及[8Fe-7S]等几种形式,不同结构的铁硫簇具有不同的生物学功能,主要包括参与电子传递、底物的结合与激活、铁/硫的存储、基因表达的调控、酶活的调控等。铁硫簇既可在生物体内合成,也可在体外进行人工组装。铁硫簇的生物合成主要和NIF、ISC、SUF这三个系统有关。研究已确定了参与铁硫簇合成的关键蛋白,但对它们分子水平上的机制及如何进行相互作用在体内外合成铁硫簇的认识尚待进一步研究。

巴西橡胶树铁硫簇支架蛋白cDNA的克隆与分析

"死皮"是指橡胶树(Hevea brasiliensis)产排胶过程中出现的一种割线症状,主要表现为割线局部或全部不排胶。为揭示"死皮"发生的分子机理,本课题组构建了死皮植株与健康植株的差减文库,从中筛选到一条在死皮植株中下调表达的基因片段,其编码的蛋白与铁硫簇支架蛋白的相似性非常高。为深入研究ISU在橡胶树"死皮"中的生物学功能,本研究对其cDNA序列进行了克隆和分析。通过ESTs序列拼接和RT-PCR,获得一条532 bp的cDNA序列(命名为HbISU1,GenBank登陆号为HM640242),该序列包含一完整的开放读码框,编码166个氨基酸,理论分子量为17.92 ku,等电点为8.99。同源序列比对表明,铁硫簇支架蛋白在不同生物中非常保守,HbISU1与蓖麻(Ricinus communis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中相关蛋白的相似性都在75%以上,与大肠杆菌(Escherichia coli)ISCU的相似性也超过50%。HbISU1含有一个IscU和NifU类蛋白所特有的保守结构域,线粒体定位,无跨膜结构域,可能是一个线粒体基质蛋白。

二核Fe/S化合物(Et_4N)_2[Fe_2S_2Br_4]的合成与结构

标题化合物(Et_4N)_2[Fe_2S_2Br_4](1)在VS_4^(3-)/FeBr_2/imnt^(2-)/Et_4NCI的反应体系中获得,它属于单斜晶系,空间群P2_1/n,主要晶胞参数为:α=0.91193(2)nm,b=1.03874(3)nm,c=1.54360(1)nm,β=105.090(1)°,V=1.41177(5)nm^3,Z=2, ρ=1.778g/cm^3,μ=6.841cm^(-1),F(000)=748,结构精修结果为:R_1=0.0287,wR_2=0.0640.簇阴离子[Fe_2S_2Br_4]^(2-)含有一个菱形Fe_2S_2单元,铁的配位几何构型明显偏离了理想的T_d对称性,导致整个阴离子的对称性降低为D_(2h).同时观察到它的Fe-Br键呈现反常加长倾向.

铁硫蛋白的生物合成及相关疾病

铁硫蛋白是以铁硫簇为辅基,相对分子质量较小的一类蛋白质.它广泛存在于各种生物体内,参与电子传递、能量代谢以及基因表达调控等重要生理过程.其生物合成过程复杂,并且从细菌到人类高度保守.在真核细胞内,铁硫蛋白的组装由线粒体铁硫簇组装系统(mitochondrial ironsulfur cluster assembly system,mitochondrial ISC assembly system)和细胞质铁硫簇组装器(cytosolic iron-sulfur cluster assembly,CIA)完成.研究发现,铁硫蛋白的合成异常可导致弗里德赖希共济失调(friedreich ataxia,FRDA)、遗传性肌病和铁粒幼细胞性贫血等多种罕见疾病,这些疾病严重影响个体的生活质量和寿命.因此,深入了解铁硫蛋白的结构和生物合成过程,对研究其生物学功能与相关疾病的诊断和治疗有重要意义.

高电势铁硫蛋白的模型化合物:2,4,6-三苯基苯硫酚的4Fe4S簇合物的合成与性质

新型簇合物（ｎ－Ｂｕ４Ｎ）２［Ｆｅ４Ｓ４（ｔｐｂｔ）４］（ｔｐｂｔ＝２，４，６－三苯基苯硫酚基）通过２，４，６－三苯基苯硫酚和（ｎ－Ｂｕ４Ｎ）２［Ｆｅ４Ｓ４（Ｓ－ｔ－Ｂｕ）４］在ＤＭＦ（二甲基甲酰胺）中进行配体交换反应合成得到。该簇合物在ＣＨ３ＣＮ溶液中的［Ｆｅ４Ｓ４］３＋／２＋和［Ｆｅ４Ｓ４］２＋／１＋的氧化还原电位分别为－０．１４和－１．３１ＶｖｓＳＣＥ（甘汞电极）。这个结果显示具有庞大位阻的２，４，６－三苯基苯硫酚配体使得其４Ｆｅ４Ｓ簇合物的［Ｆｅ４Ｓ４］３＋态相对稳定。

生物磁受体蛋白MagR/IscA研究进展

铁硫簇蛋白是一类重要的线粒体功能蛋白,在细胞能量代谢、电子传递、底物结合与激活、铁/硫存储、酶促反应、基因表达调控等诸多过程中均发挥了关键作用.铁硫簇蛋白质组装及转运过程一旦发生障碍,必将严重影响细胞内铁的稳态及铁硫蛋白的功能.分子质量约11 ku的铁硫簇蛋白IscA,是铁硫蛋白亚家族hesB高保守性成员之一,能结合铁离子及[2Fe-2S]簇,参与铁硫簇蛋白质合成,因此IscA在铁硫簇组装蛋白与级联反应系统中具有重要的作用.更值得关注的是,2015年谢灿和张生家两个研究组发现IscA1具有磁受体(MagR/MAR)作用,此外,谢灿课题组揭示MagR能与Cry形成磁感应复合物行使磁感应器(magnetic sensor,MagS)功能.尤为重要的是,体内实验表明通过外磁场刺激活化MagR能调控相关磁基因表达,影响神经活动及行为定位.鉴于MagR磁受体的独特功能,张生家等将磁受体的基因定位与远程磁刺激相结合,发明了一种非损伤性的神经调控方法,称之为磁遗传学.本文简要介绍MagR/IscA及其同源基因的始初发现与鉴定历程、进化保守性、独特的生理生物学功能,并凝练出磁遗传假说机制调控模型,以解释MagR/IscA的磁遗传学功能.

铜死亡在脓毒症急性肝损伤中的作用

目的探讨铜死亡在脓毒症急性肝损伤中的作用。方法50只雄性C57BL/6J小鼠均分为盲肠结扎穿刺术诱导脓毒症组(CLP组,n=25)和假手术组(Sham组,n=25),术后24 h采集心脏血及分离肝组织,采用全自动生化分析仪检测2组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平,采用苏木精-伊红染色法(HE)染色观察2组小鼠肝脏组织的形态学特征,采用蛋白印迹法检测2组小鼠肝脏组织中铁氧还蛋白1(FDX1)、硫辛酸合成酶(LIAS)、二氢硫辛酸转乙酰基酶(DLAT)、二氢硫辛酸琥珀酰转移酶(DLST)、琥珀酸脱氢酶B(SDHB)、硫辛酰化DLAT(Lip-DLAT)、硫辛酰化DLST(Lip-DLST)蛋白的表达,采用免疫组织化学(IHC)技术检测2组小鼠肝脏组织中FDX1、Lip-DLAT及Lip-DLST的表达和定位情况;取对数生长期的人肝癌HepG2细胞,分为脂多糖(加50 mg/L脂多糖,刺激细胞24 h)组和空白对照组(不做任何处理),采用蛋白印迹法检测2组HepG2细胞中FDX1蛋白的表达。结果CLP组小鼠血清ALT、AST较Sham组均明显升高(P<0.01),HE染色可见CLP组小鼠肝细胞明显肿胀坏死,上述结果表明脓毒症导致急性肝损伤小鼠模型建立成功;CLP组小鼠肝脏组织中FDX1、LIAS、DLAT、DLST、SDHB、Lip-DLAT及Lip-DLST的表达较Sham组均降低(P<0.05),脂多糖组HepG2细胞中FDX1表达低于对照组(P<0.05);免疫组织化学染色显示,2组小鼠肝脏组织中FDX1、Lip-DLAT及Lip-DLST均主要表达于肝细胞的细胞质内,且CLP组小鼠肝组织中FDX1、Lip-DLAT及Lip-DLST表达均较Sham组减少(P<0.05)。结论在盲肠结扎穿刺术制作的脓毒症模型小鼠和脂多糖刺激的脓毒症细胞模型中,铜死亡参与了脓毒症急性肝损伤的发生发展过程。

嗜铁钩端螺旋菌中铁硫簇相关蛋白的生物信息学分析

利用在线分析软件对嗜铁钩端螺旋菌中9种与铁硫簇结构、功能及生物合成相关蛋白质基本性质、活性位点、结构和蛋白相互作用网络等方面进行了预测。9种蛋白质包含7种酶和2种非酶蛋白,酶类蛋白与机体蛋白质裂解,翻译、信号转导和能量代谢相关,非酶类蛋白为生长因子和转运结合蛋白。所有蛋白的稳定性和等电点均有差异。WP_014960240.1、WP_014960241.1、WP_014960239.1和WP_014960235.1在ISC和NIF系统中发挥着重要的作用,参与铁硫簇的组装;WP_014959988.1可能主要参与细胞生长;WP_014960813.1和WP_014961639.1可能在能量代谢中发挥重要的作用;WP_014961659.1与铜金属解毒机制有关;WP_014962089.1参与亚硝酸盐的还原。该研究为进一步用分子生物学方法验证其相互作用机制提供给了理论依据,同时为菌株改良和生物浸矿奠定理论基础。

真核细胞中铁硫簇的组装机制及相关铁硫蛋白疾病

铁硫簇是一类古老而功能众多的蛋白质辅基,在细胞中参与电子传递过程、酶促反应及感知内环境的变化而调节基因的表达等。虽然铁硫簇的组成元素和结构都较为简单,但是铁硫簇的组装是需多种组装蛋白参与、有序进行的催化反应。直至近几年,人们才逐渐阐明了在生命体中铁硫簇是如何组装并结合到未成熟的铁硫蛋白中的。如果线粒体中铁硫簇组装及转运过程发生障碍,将严重影响细胞内铁的稳态及铁硫蛋白的功能,由此可见,线粒体中铁硫簇的组装功能使得线粒体成为细胞中必不可少的一类细胞器。该文重点概述了近十年来真核生物中铁硫簇组装机制的研究进展并阐述线粒体铁硫簇组装在人体中的重要作用及其组装障碍所引起的疾病。

铜对线粒体中铁硫蛋白功能的毒性机制研究

该文探讨了铜对线粒体内铁硫蛋白的毒性机理。通过包装慢病毒将Hep G2细胞中铜转运蛋白ATP7B(ATPase copper transporting beta)基因敲低,并用铜离子处理构建高铜细胞模型。通过免疫印迹、胶内酶活、紫外–可见光分光光度法检测细胞线粒体内铁硫蛋白、非铁硫蛋白及铁硫簇组装蛋白量和活性的改变;用电镜观察高铜模型中线粒体的形态改变;用海马能量代谢分析仪检测铜离子对细胞能量代谢的影响。结果发现,高铜细胞模型线粒体内铁硫簇组装蛋白ISCA2(ironsulfur cluster assembly 2)及ISCU(iron-sulfur cluster assembly enzyme)水平下降,抑制了铁硫簇的组装,并进一步影响了线粒体内[2Fe-2S]型及[4Fe-4S]型铁硫蛋白功能,但并不影响非铁硫蛋白。高铜状态也影响了呼吸链复合体活性及线粒体能量代谢,并导致线粒体形态发生改变。这些结果表明,异常累积的铜离子也会通过抑制线粒体中铁硫簇的组装,影响线粒体内铁硫蛋白的功能。

Salmonella enteric硫修饰蛋白DptC半胱氨酸定点突变对Dnd表型的影响

【目的】Salmonella enterica serovar Cerro 87是具有硫修饰现象即Dnd表型的细菌之一,其硫修饰受dptBCDE基因簇控制,将dptBCDE克隆、转化Escherichia coli DH10B后,可赋予后者Dnd表型,而当其中dptC缺失后,Dnd表型随之丧失。本文探索S.enterica serovar Cerro 87硫修饰基因dptC在硫修饰发生过程中的作用。【方法】将DptC中6个半胱氨酸(Cys)在DNA水平上逐个定点突变,转化携带dptBCDE及其衍生系列的质粒至E.coli DH10B,检测相应受体菌Dnd表型。【结果】在DptC的6个Cys中,除C39外,其余5个突变均可导致Dnd表型丧失,说明DptC中C146、C262、C273、C280和C283均与硫修饰有关。生物信息学分析表明,这5个Cys在硫修饰细菌科属间高度保守,佐证了S.enteric DptC中这5个Cys与硫修饰有关的结论。【结论】S.enteric DptC中C146、C262、C273、C280和C283任何一个的突变,都会导致受体菌Dnd表型丧失。该结果为进一步探索DNA硫修饰的发生机制提供了线索。

低表达线粒体蛋白ISCA2对线粒体功能影响的机制研究

该文探讨了ISCA2蛋白低表达对细胞内铁硫蛋白和能量代谢的影响。在HeLa细胞内将ISCA2基因敲低,通过免疫印迹、顺乌头酸酶胶内酶活性分析法分析线粒体内外铁硫蛋白水平和活性改变;用紫外–可见分光光度法检测细胞线粒体内氧化磷酸化复合体活性;用海马能量分析仪分析细胞内能量代谢的改变。结果表明,ISCA2蛋白低表达后,氧化磷酸化复合体中各铁硫蛋白亚基都出现不同程度的下调,且对于线粒体[4Fe-4S]型铁硫蛋白亚基影响显著,但对线粒体[2Fe-2S]型铁硫蛋白亚基以及胞质[4Fe-4S]型铁硫蛋白亚基影响较小。同时,ISCA2蛋白低表达后对线粒体复合体活性和线粒体能量代谢影响显著,细胞有氧呼吸降低,细胞外乳酸含量增加。这些结果表明,ISCA2蛋白低表达后抑制铁硫簇的组装,导致铁硫蛋白功能障碍,影响线粒体复合体活性和氧化磷酸化系统,使得细胞能量代谢紊乱。

铁硫簇组装蛋白在意大利蜜蜂耐受吡虫啉毒害中的应答分析

【目的】用生物信息学方法鉴定意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)铁硫簇组装蛋白(AmIscA),分析它在意大利蜜蜂工蜂耐受杀虫剂吡虫啉毒性中的应答特征。【方法】多重序列比对分析AmIscA的氨基酸序列特征和结构域组成;在线预测该蛋白的结构以及互作蛋白网络,预测它的生物学功能;构建系统进化树分析该蛋白的分类和进化关系;构建半致死模型,实时荧光定量PCR分析AmIscA基因在工蜂耐受杀虫剂吡虫啉毒性0~48h中的表达特征。【结果】AmIscA基因cDNA序列全长514bp,编码130个氨基酸残基,计算出AmIscA的相对分子质量为14.1kDa,pI为9.06。AmIscA为疏水性蛋白,具有铁硫簇组装蛋白保守的半胱氨酸和天冬氨酸残基,并且不具备信号肽,定位于线粒体中。经48h的半致死剂量吡虫啉暴露后的工蜂存活率为45%±5%。AmIscA基因表达受吡虫啉胁迫而上调,且呈先升高后下降趋势。【结论】AmIscA积极响应吡虫啉导致的毒性胁迫,可能通过抗氧化作用潜在地参与了意大利蜜蜂对吡虫啉毒性的耐受。

结核分枝杆菌WhiB2蛋白的表达纯化及理化性质和生物信息学分析

目的探索结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)WhiB2蛋白的作用机制。方法构建Mtb中pET28a-WhiB2重组表达载体,异源表达并纯化WhiB2蛋白和包涵体WhiB2蛋白;圆二色谱和核磁共振分析包涵体WhiB2与非变性WhiB2蛋白的差异;加入Fe^(2+)恢复WhiB2蛋白的铁硫簇;核磁谱图分析WhiB2与WhiBMtb基因上游的启动子序列相互作用;生物信息学分析其三级结构、三级结构比对和相互作用蛋白质。结果复性的WhiB2与非变性WhiB2的结构基本一致,在破坏了铁硫簇的WhiB2中加入Fe^(2+)能够成功恢复自身的铁硫簇,WhiB2可以与WhiBMtb/WhiB2Ms基因上游的启动子序列结合。结论Mtb WhiB2蛋白在结核病发病机制中起关键作用,为进一步探索抗Mtb的新型靶点提供基础资料。