液体或固体培养对环链棒束孢(Isaria cateinannulata)菌丝体中挥发性成分组成的影响

【目的】测定环链棒束孢(Isaria cateinannulata)在不同培养方式下,其菌丝中挥发性代谢物组成,分析代谢产物差异与培养方式间的相互联系。【方法】分别用SDAY培养基固体平板与SDY培养基液体摇瓶的培养方式进行培养;培养温度为25℃,培养周期为8天;用同时蒸馏萃取装置提取菌丝的挥发性成分;用气质联用仪进行数据采集及分析。【结果】固体培养菌丝体含有较多种类的挥发性成分,共鉴定41种化合物,其中酯类、醌类和肟类化合物为其特有。液体培养菌丝体含有的挥发性成分相对较少,共鉴定32种化合物,其中羧酸类化合物为其特有,同时酚类含量远高于固体菌丝。固体和液体培养菌丝体的主要挥发性成分都是烃类物质,其中烯烃类物质分别占固体培养菌丝和液体培养菌丝总挥发物的57.6%和7.85%,烷烃类物质分别占固体培养菌丝和液体培养菌丝总挥发物的9.19%和22.4%。【结论】固体或液体培养条件对环链棒束孢菌丝体中挥发性成分的组成有影响。

环链棒束孢Isaria cateinannulata发酵液的化学成分分析

环链棒束孢广泛存在于自然界,并且在植物病虫害防治中起重要作用,目前相关的研究多集中于其发酵条件、生物学特性及杀虫毒力的研究,对该菌发酵液中的化学物质研究甚少。本文依次用石油醚和乙酸乙酯对环链棒束孢发酵液进行分级萃取,借助气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术和超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱法(UPLC/Q-TOF-MS)鉴定分析石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和萃余物中的化学物质组成。共鉴定69个化合物的结构,其主要化学成分为酚类、酯类、烷烃、烯烃、卤代烃和酮类非极性/弱极性的小分子化合物等,其中邻苯二甲酸二丁酯、角鲨烯、环戊烯丙菊酯物质、瓜叶菊素Ⅰ等物质具有特殊的作用。发酵液提取物中还含有多种小分子化学物质,应结合多种色谱分离手段和波普学手段对代谢产物进行分离、纯化和结构鉴定,为其次生代谢产物的广泛利用提供数据支撑。

环链棒束孢生长曲线的测定

明确环链棒束孢的生长曲线,为环链棒束孢代谢物的采集、孢子规模化生产奠定基础。采用重量法、显微直接计数法、比浊法3种方法对环链棒束孢2018 BY-1菌株的生长规律进行研究。结果表明,环链棒束孢的生长规律为0~3 d为迟缓期,3~5 d为对数期,5~6 d为稳定期,6 d以后为衰亡期;最大吸收波长为410 nm,此时菌丝干重、OD410值、孢子数均达到最大值,分别是0.22±0.00 g、0.64±0.03、4.14×10^(8)个/mL;对数期的OD值和孢子数存在线性关系;稀释培养基的浓度可以降低培养基中色素对菌液的影响。

防治斜纹夜蛾蛹和2龄幼虫的棒束孢菌株筛选

为获取对斜纹夜蛾Spodoptera litura(Fabricius)具致病力的生防真菌资源,通过对8株寄主为鳞翅目蛹的棒束孢属Isaria spp.真菌进行形态学和分子系统学鉴定;以斜纹夜蛾的蛹和2龄幼虫为试虫,分别采用拌土法和浸渍法测试菌株的致病力。结果显示:菌株GZUIFR08XS1、GZUIFR04XS8、GZUIFR08XS13为环链棒束孢I.cateinannulata,菌株GZUIFR08LYS4、GZUIFR04XS5、GZUIFR04XS7、GZUIFR08XS12、GZUIFR04XS16为粉棒束孢I.farinose。8株菌对斜纹夜蛾的蛹和2龄幼虫均有致病力。土壤接种5 mL浓度为2×10^8个/mL的分生孢子,环链棒束孢GZUIFR08XS1、GZUIFR04XS8对蛹的致死率均为100%。接种浓度为1×10^8个/mL的分生孢子,环链棒束孢GZUIFR04XS8对2龄幼虫致死率为(78.21±2.22)%,较其他菌株有差异显著(P<0.05)。将环链棒束孢GZUIFR04XS8分别接种在2~5龄幼虫时,对同一龄期幼虫的致死率随接种浓度的增大而上升,其中,接种孢子浓度为1×10^9个/mL可致2龄幼虫100%死亡;同一接种浓度下,对幼虫致死率随幼虫龄期的增大而下降,其中,2龄幼虫的致死中浓度LC50为1.28×10^5个/mL。环链棒束孢GZUIFR04XS8有较好防治斜纹夜蛾蛹和低龄幼虫的生防潜力。

环链棒束孢IcHsp104与IcHsp78的克隆及在不同胁迫条件下的表达检测

【背景】环链棒束孢(Isariacateinannulata)是一种重要的虫生真菌,许多环境因子的胁迫作用影响了该菌在田间的生防效果。【目的】热休克蛋白酪蛋白溶解蛋白酶(HeatShockProteinCasein LyticProteinase,Hsp100/Clp)是一类ATP依赖型Hsp100家族蛋白,克隆该菌株Hsp100/ClpB家族的2个关键基因IcHsp104与IcHsp78,探索该对基因在应对不同温度及盐浓度胁迫下的作用。【方法】通过前期获得的转录组数据库,采用本地BLAST方法对环链棒束孢Hsp100家族基因进行分析筛选。通过RT-PCR技术,对环链棒束孢Hsp100基因的编码区(Open Reading Frame,ORF)进行碱基验证。通过分子生物信息学分析软件,对环链棒束孢Hsp100基因的氨基酸结构、进化树、功能结构域和三级结构进行分析。通过不同温度及盐浓度处理菌株,采用荧光定量PCR(Real-TimeQuantitative PCR,RT-qPCR)技术,对获得的基因进行表达检测。【结果】共筛选出2个环链棒束孢Hsp100/ClpB基因Hsp104与Hsp78,将其命名为IcHsp104与IcHsp78,2个基因分别编码923个和805个氨基酸,分子量分别为103.199 kD和88.805 kD;2个基因均与棒束孢属、白僵菌属和虫草属3个物种的亲缘关系最近,但2个基因之间的同源性较低;2个基因编码的蛋白均为经典的AAA+-ATPase家族蛋白,三级结构以α螺旋为主。另外,经高低温处理菌株后,2个基因的表达均会上调,并随处理时间的延长上升越显著,而且高温胁迫组显著强于低温组。经不同浓度氯化钠处理后,低浓度组2个基因的表达量均上调,高浓度组2个基因的表达量均受到抑制。【结论】环链棒束孢IcHsp104与IcHsp78基因在抵抗外界温度及盐胁迫过程中起到重要的作用,为后续环链棒束孢应对环境胁迫的机理研究提供了理论基础。