Islet-1基因变异体的发现及其在神经干细胞内的表达

目的:构建大鼠Islet-1基因逆转录病毒表达载体,利用此载体将Islet-1基因转导入神经干细胞(NSC)内。方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,将其插入到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,利用包装细胞PA317将Islet-1基因转导入NSC内,观察Islet-1基因在NSC内的表达。结果:经PCR、酶切及荧光检测等证实,成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体,并应用免疫组化技术证明Islet-1在NSC内有表达。在实验中首次发现了Islet-1基因的变异体。结论:重组Islet-1基因逆转录病毒载体的构建为进一步探讨Islet-1基因是否参与NSC向运动神经元分化及其可能的作用机制奠定了坚实的实验基础。

小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建

目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度。感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点(抑制效率分别为76.8%5、5.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P<0.05)。结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。