慢病毒介导的Isll基因在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的研究慢病毒介导的Isll基因在人骨髓间充质干细胞（hMsc）中的表达情况，并检测其下游基因Nkx2．5和Flk一1的表达。方法多位点Gateway载体构建技术构建2K7puro／EF1α-Isll慢病毒表达载体（由EF1α启动子启动Isll基因表达）。包装细胞293FT细胞获得慢病毒，再转染至hMSC。利用嘌呤霉素抗性筛选出Isll阳性细胞。应用RT．PCR、Westernblotting检测hMSC中Isll基因在转染后1-6周的mRNA和1—4周的蛋白表达情况。结果成功构建了慢病毒载体EF1α—Isll，转染后hMSC中检测出Isll基因mRNA和蛋白的表达，其mRNA表达随着培养时间延长而上调，第3周表达量（0．65±0．14）较1、2周增多（0．36±0．09，0．37±0．05，均P〈0．05），3周后表达趋于稳定。转染后在无任何诱导剂的情况下，检测到Isll下游基因Nkx2．5的表达，但尚未见Flk-1的表达。结论通过慢病毒载体将Isll基因转染hMSC后，可获得长期稳定的表达，并在无任何诱导剂的情况下，能促进下游基因Nkx2．5的表达。

Isl1在后肢发育过程中的表达及作用

目的研究Isl1在后肢发育过程中的表达及作用。方法使用Isl1-nLacZ、Isl1-Cre、HoxB6-Cre和Isl1^(f/f)小鼠模型,以及X-gal染色、骨染色、组织分析方法研究Is1l在后肢发育过程中的表达及作用。结果随着小鼠后肢开始发育,在胚胎期第10.5天,Isl1在后肢原基高表达。在胚胎逐渐发育至胚胎期第12.5天的过程中,Isl1在后肢的表达逐渐下调。在胚胎期第12.5天,Isl1仅在后肢的最后部表达。但在胚胎期第13.5、15.5天,Isl1在后肢的后半部表达明显升高,主要在后肢骨骼肌细胞中表达。Isl1-Cre谱系研究显示,lsl1参与后肢的骨和骨骼肌细胞的形成。利用HoxB6-Cre在后肢中敲除Isl1可导致突变鼠后肢发育严重异常,伴有坐骨,耻骨,腓骨和跟骨及脚趾骨发育不良或缺失,突变鼠5号脚趾缺失最多见,而1号脚趾缺失累及较少。突变鼠后肢骨骼肌细胞的中央核比例远高于对照组。结论 Isl1在小鼠后肢发育过程中动态表达,参与后肢骨骼肌细胞和骨细胞的发育,对后肢发育过程中近一远和前后轴的建立起重要作用。

利用CRISPR/Cas9技术构建CreERT2定点敲入Isl1基因小鼠模型及分析

心肌祖细胞增殖和分化是心脏损伤后修复再生的基础,而Isl1被认为是心肌祖细胞的特异性标志。为了研究以及示踪Isl1+心肌祖细胞及其分化后代,该文尝试利用成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR/Cas9系统,将Cre ERT2定点插入到小鼠Isl1内源基因启动子之后,建立了Cre ERT2基因敲入小鼠模型。通过与Rosa26-lox P-neo-lox P-lac Z小鼠(Rosa26-lac Z+)交配,获得Isl1-Cre ERT(KI)/Rosa26-lac Z+双杂合小鼠。经过基因型鉴定、组织表达谱测定和X-gal染色、冰冻切片和石蜡切片等方法,确认基因敲入小鼠的Cre ERT2表达在成年小鼠心脏窦房结、心脏神经节、主动脉弓和肺动脉根部,与文献报道的Isl1表达部位相同。该研究建立的模型可为研究心肌祖细胞的增殖和谱系示踪提供重要的模型。