基于iTRAQ技术的阿司匹林相关胃黏膜病变差异蛋白质组学研究

目的应用同位素相对标记与绝对定量技术(isotope relative labeling and absolute quantification technique,iTRAQ)筛选阿司匹林相关胃黏膜病变的差异蛋白,分析生物信息,探讨阿司匹林导致胃黏膜病变的发病机制。方法分别收集口服阿司匹林6个月以上患者的胃黏膜病变(包括胃炎、胃溃疡)标本作为实验组,未口服阿司匹林健康体检者的正常胃黏膜标本作为对照组,采用iTRAQ技术对差异蛋白进行筛选与鉴定。通过检索Gene Ontology数据库,针对细胞组分、生物学过程、分子功能对差异蛋白在功能方面进行富集;通过KEGG的Pathway数据库,定位差异蛋白到相应的生化代谢途径和信号转导途径,将不同的蛋白质富集到共同代谢途径中。结果共鉴定出298个差异蛋白,与对照组相比差异有统计学意义,其中235个蛋白表达上调,63个蛋白表达下调。生物信息学分析发现差异蛋白主要参与了129种细胞组分、733种生物学过程、123种分子功能、55条信号转导通路。差异蛋白的基因分子功能主要包括异源性二聚体蛋白的活性、MAPK级联反应、受体激动剂活性、CCR10趋化因子受体结合、氨甲酰磷酸合成酶活性、CXCR5趋化因子受体结合、H-K交换ATP酶活性等,差异蛋白主要富集在内吞作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路上。结论阿司匹林可能通过上调或下调多种差异蛋白,如下调EGFR参与内吞作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用等多种信号途径损伤胃黏膜。为进一步阐明阿司匹林相关胃黏膜致病机制提供了理论依据。

稳定同位素标记氨基酸细胞培养联合质谱绝对定量技术在5、7、55型腺病毒鉴定中的应用

利用稳定同位素标记肽段的质谱绝对定量(AQUA)技术,实现了对5、7和55型人腺病毒的准确鉴定。采用细胞培养条件下稳定同位素代谢标记(SILAC)技术培养细胞至大肠杆菌生长至对数生长期,1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)低温诱导蛋白表达,提取并利用谷胱甘肽S转移酶(GST)纯化富集相应标记的腺病毒六邻体蛋白。通过胶消化分别消化三种不同标记策略(非标记、中度标记和重度标记)的纯化蛋白,消化肽段等量混合脱盐后经纳流液相色谱-串联质谱(Nano HPLC-MS/MS)进行定量蛋白分析。通过SILAC实现大肠杆菌的完整代谢标记,诱导表达腺病毒六邻体蛋白,通过AQUA技术实现对非标记、中度标记、重度标记六邻体蛋白标志性肽段鉴定。成功实现SILAC三种不同标记策略条件下大肠杆菌中5、7、55型人腺病毒六邻体蛋白的完整标记,为5、7、55型人腺病毒感染的快速分型检测提供了新的鉴定策略。

应用iTRAQ-HPLC-MS技术筛选奶牛脂肪肝病尿液蛋白标志物

应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术筛选并鉴定脂肪肝病奶牛尿液中的差异表达蛋白,为诊断奶牛脂肪肝病提供新的生物标志物。收集40头奶牛的尿液,分为脂肪肝病组A1、A2和健康对照组B1、B2,每组各10头奶牛。组内每10个样品等量混合后进行试验,将符合要求的样品进行iTRAQ标记后利用高效液相色谱法层析,经串联质谱鉴定。共筛选出110个差异表达蛋白,其中50个表达下调,60个表达上调;通过生物信息学分析得到了4个关键性蛋白:玻连蛋白(Vitronectin,VTN)、脂质运载蛋白(Lipocalin,LCN2)、凝血酶原(Prothrombin,F2)和丛集素(Clusterin,CLU)。本试验成功筛选出脂肪肝病奶牛尿液中的差异表达蛋白,并鉴定出其中4种与奶牛脂肪肝病存在密切关系的关键性调节因子,如能进一步证实为奶牛脂肪肝病的重要生物标志物,将会为奶牛脂肪肝病的早期检测和诊断提供新的方法。

年龄相关性听力减退小鼠耳蜗核iTRAQ定量蛋白质组学研究

目的研究年龄相关性听力减退小鼠耳蜗核蛋白质组学随增龄产生的差异,探讨低级听觉中枢在老年性耳聋发病机理中的作用。方法运用脑干电反应测听(ABR)检测2月龄及12月龄C57BL/6J小鼠的听阈,结合同位素标记的相对与绝对定量(iTRAQ)和Q Exactive质谱及生物信息学等多重技术分析两组之间耳蜗核差异蛋白。结果两组中总共鉴定到5919个蛋白质,39269个唯一肽段。符合表达差异倍数大于1.2倍且P<0.05筛选标准的差异表达蛋白质70个。其中上调差异表达蛋白44个,下调差异表达蛋白26个。结论iTRAQ定量蛋白质组学技术可有效地运用于组织蛋白鉴定和相对与绝对定量;采用该技术获得了年龄相关性听力减退小鼠耳蜗核蛋白质组差异表达图谱;深层次研究这些蛋白的分子机制将有助于阐明老年性耳聋尤其是中枢性老年性耳聋的发病机理及发现潜在的标志物,为老年性耳聋的诊断和治疗提供新的分子靶位。

颞下颌关节骨关节病关节液的定量蛋白质组学研究

目的鉴定颞下颌关节骨关节病(TMJOA)患者关节液中蛋白质表达情况,筛选出生物标志物,并初步探讨其发病机制。方法选择2019年5~10月22例于我院行颞下颌关节玻璃酸钠注射治疗的TMJOA患者作为实验组,收集同期10名健康志愿者作为健康对照组,采集两组受试者关节液标本,应用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)-LC-MS/MS检测和鉴定差异蛋白,对差异表达的蛋白进行生物信息学分析。结果共鉴定出蛋白370个,与健康对照组相比,实验组中差异表达蛋白82个,其中上调蛋白35个,下调蛋白47个(差异倍数≥1.5或≤0.67,P≤0.05)。差异蛋白主要参与的生物学过程有:cellular process,metabolic process,biological regulation,response to stimulus等;主要涉及的分子功能包括:binding,catalytic activity,enzyme regulator activity等;差异蛋白主要富集在PPAR signaling pathway通路。结论 iTRAQ-LC-MS/MS技术成功筛选到多个与TMJOA发病相关的蛋白,C4BPA、CD5L、PRDX2、CAH1可作为TMJOA诊断的候选生物标志物和潜在治疗靶点。