J亚群禽白血病病毒血液核酸筛查技术的建立

为缩短J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus, ALV-J)检测周期,进一步加快禽白血病净化进程,本研究结合SYBR GreenⅠqPCR和混样检测,建立了一种适用于低ALV-J流行率场景下的快速筛检ALV-J的血液核酸筛查技术(ALV-J blood quantitative polymerase chain reaction, ALV-J-B-qPCR)。根据GenBank中ALV-J pol及env基因序列,设计ALV-J的特异性引物,并优化反应条件,建立了ALV-J SYBR GreenⅠqPCR检测方法。以ALV-J病毒分离为阳性的鸡抗凝血为实验材料,分别制备抗凝血DNA、血细胞DNA、外周血淋巴细胞DNA、外周血淋巴细胞cDNA和血浆cDNA 5类血液检测模板进行ALV-J的PCR检测,筛选最佳检测模板;进一步比较蒸馏水破裂红细胞法提取混合血液DNA的混样方法,血液混样总体积为200μL的混样方法,血液混样总体积为10μL的混样方法共3种混样方法的检测准确性,筛选最佳混样方法。综合上述qPCR方法、检测模板与混样方法,成功建立了ALV-J-B-qPCR。运用ALV-J-B-qPCR分别进行预期流行率为1%~2%、4%~5%场景下的模拟筛查试验,并与病毒分离法比较。qPCR方法的特异性、灵敏性和重复性试验显示,该方法仅特异性扩增ALV-J,对标准质粒的最低检测限度为1×10^(2)copies·μL^(-1),批内与批间变异系数均<1%。对90份临床送检血液样品的检测结果显示,该qPCR方法对ALV-J的检出率(15.6%)高于p27抗原ELISA和普通PCR的检出率(12.2%)。检测模板筛选试验中,抗凝血DNA最符合检测准确度高、操作复杂度和成本低的要求,为最佳检测模板。混样方法摸索试验中,混样总体积为10μL(混样规模<12份)的混样方法检测准确性最高,为最佳混样方法。在样本数为400份,预期流行率为4%~5%场景的模拟筛查中,ALV-J-B-qPCR检出率为6.25%,比病毒分离法高2.00%;在样本数为400份,预期流行率为1%~2%场景的模拟筛查中,ALV-J-B-qPCR检出率为2.25%,比病毒分离法高0.75%。本研究建立的ALV-J-B-qPCR技术具有灵敏性高、检测快速和节约成本的优势,为种禽场加快ALV净化进程提供了新的思路和方法。

竹醋液抑制J亚群禽白血病病毒复制研究

为探讨竹醋液在体外对J亚群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)复制的影响,研究首先通过CCK-8试剂盒测定青皮竹和慈竹两种竹醋液对DF-1细胞毒性,随后将不同浓度竹醋液与ALV-J等体积室温作用不同时间后接种到细胞中,利用qRTPCR、ELISA和Western blot测定竹醋处理对ALV-J编码基因的转录以及蛋白合成的影响。结果显示:两种竹醋液加入细胞中的最终浓度均≤2%,对细胞生长没有影响;青皮竹醋和慈竹醋在100%、50%、25%的浓度下与病毒在室温作用10 min、30 min后,细胞中gp37基因表达水平显著下降,细胞与上清中的P27蛋白表达水平也明显下降。研究表明,青皮竹醋和慈竹醋在体外均有明显的抗ALV-J活性。

用ALV-Jgp85单克隆抗体证明蛋鸡存在J亚群禽白血病

采用免疫组化法,对病理学初步诊断为蛋用型鸡 J亚群白血病的自然发病鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、心脏、胰脏、输卵管、卵巢、腺胃、骨骼肌、大脑、坐骨神经,用特异性抗 J亚群禽白血病病毒(ALV J)囊膜糖蛋白gp85的单克隆抗体进行检测,待检的组织切片中均检出阳性抗原,免疫组化的研究结果与病理学诊断结果相一致。在国内外首次发现并报道蛋用型鸡 J亚群禽白血病的自然病例。

鸡感染J亚群禽白血病病毒的免疫抑制机理

通过人工接种建立了雏鸡感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)后发生免疫抑制的病理模型,对免疫抑制的机理进行了初步研究。结果表明:ALV-J感染早期可诱导胸腺、法氏囊的淋巴细胞凋亡,这种早期的淋巴细胞凋亡是胸腺和法氏囊萎缩的重要原因之一。病理组织学动态观察表明,ALV-J主要引起骨髓的髓系细胞灶状或弥漫性增生,病变导致骨髓机能受损,使机体免疫机能下降,是引起免疫抑制的根本原因。病毒感染组免疫器官均发生了严重的实质萎缩性病变,这种病变的发生除与骨髓的病变及淋巴细胞凋亡有关外,还与中后期淋巴细胞的坏死有关,从而导致严重的免疫抑制。ALV-J感染可引起免疫器官及部分内脏器官中嗜酸性粒细胞样的瘤细胞浸润增生,这可以作为病毒感染早期的病理诊断指标。

间接荧光抗体法快速诊断海兰褐蛋鸡J亚群禽白血病的研究

某地区海兰褐蛋鸡发生肿瘤性传染病 ,经临床症状和病理学检查 ,在肝、脾、肾、卵巢、输卵管、肺、骨髓、腺胃、肠道等可见胞浆内充满球形嗜酸性颗粒的骨髓瘤细胞 ,呈灶状或弥漫性的分布。该变化是禽骨髓细胞瘤病病理学的特征性变化 ,具有证病意义。经用特异性抗 J亚群白血病病毒囊膜蛋白 gp85的单克隆抗体的免疫组化方法 ,在病料组织切片上检出病毒抗原 ,从而确诊为蛋鸡 J亚群禽白血病。本研究是尝试用间接荧光抗体法来快速诊断该病。采用特异性抗 J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白 gp85单克隆抗体对组织触片作间接荧光抗体试验 ,检测 J亚群禽白血病病毒抗原。在骨髓、食管、肌肉、输卵管、肾都出现了范围广而且很明亮的荧光 ;肝、肺、脾的荧光较为明亮 ;心脏的荧光较弱 ,但清晰可见。表明在病料组织中存在特异性病毒抗原。

商品代肉鸡J亚群禽白血病的病理及病毒分离鉴定

通过对山东某肉鸡养殖场发病的商品肉鸡组织病理学检查和将病料接种鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,我们在国内首次从商品代肉鸡中分离到了 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。从组织切片中可以看到肝脏、脾脏等器官的髓细胞瘤细胞 ,呈散在或成簇 ,髓细胞瘤细胞的细胞质内显现嗜酸性颗粒。用抗 AL V- J囊膜糖蛋白的单克隆抗体进行的 IFA中 ,病料接种 CEF后进行的

J亚群禽白血病病毒SCAU-0901株的分离鉴定

在组织病理学观察的基础上,经接种DF-1细胞系、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA),从送检的疑似禽白血病感染的麻黄肉种鸡中分离并鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为SCAU-0901。利用特异性引物分别扩增出长度为545 bp和2.2×103bp的目的片段,并对目的片段进行了克隆测序。序列分析发现,SCAU-0901株的gp85基因与国内外各ALV-J毒株相应核苷酸序列的相似性为86.1%～95.1%,其中与BJ0303株的相似性最高(95.1%),与ADOL-7501株的相似性最低(86.1%)。系统遗传进化分析表明,SCAU-0901株的gp85基因片段与BJ0303株的亲缘关系最近。

上海地区蛋鸡J亚群禽白血病的血清学调查

采用ELISA法对上海地区4个蛋鸡场共72份血清进行J亚群禽白血病的血清学调查,结果表明,2个疑似感染J亚群禽白血病的商品代蛋鸡场抗体阳性率分别为25%和15%,另2个无白血病临床症状蛋鸡场的抗体阳性率分别为0和8.3%。血清学调查结果表明,上海地区已存在J亚群禽白血病。对发病鸡场鸡新城疫免疫抗体检测结果表明,抗体阳性率均为100%,抗体效价平均值分别为9.4log2和10.65log2,说明鸡群感染ALV-J对鸡新城疫疫苗免疫效果几乎没有影响。

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。

上海地区商品代蛋鸡J亚群禽白血病的病理学观察

对上海地区2个规模化商品蛋鸡场疑似禽白血病病例进行了组织病理学观察和ELISA检测,发现发病鸡群中血管瘤占50%,纤维肉瘤占37.5%,髓细胞瘤占12.5%,J亚群禽白血病的血清抗体阳性率分别达25%和15%。血管瘤主要见于脚部和翅膀,组织病理学观察表明为海绵状血管瘤,纤维肉瘤主要见于肌肉组织内,对弥漫性肝、脾肿大的病例观察表明肿瘤组织为髓细胞瘤。证实该鸡群感染了J亚群禽白血病病毒,并表现为以髓细胞瘤、血管瘤和纤维肉瘤为主的多种肿瘤性传染病。

血管瘤相关J亚群禽白血病病毒ZH-08株的分离与全基因组序列测定

本研究从临床表现为典型血管瘤型禽白血病病例的广东某肉种鸡场的病鸡中,分离到1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为ZH-08。利用ELISA抗原检测、PCR和间接免疫荧光试验对分离株进行鉴定,结果都呈阳性。依据ALV-J原型株HPRS-103前病毒全基因组序列设计并合成3对引物,采用分段扩增的方法完成了分离株的全基因组序列测定。结果显示该分离株基因组序列全长7 597 bp,与已公开的全基因组序列大小比较略有差异,但符合典型的复制完全型反转录病毒的基因组结构,基因序列中不含已知致癌基因。将该分离株的亚群特异性gp85基因序列与国内外各参考株相应序列进行相似性比较,发现ZH-08与YZ9901株相似性最高(93.7%)。基于gp85核苷酸序列的系统进化分析表明:ZH-08株与SD07LK1株的亲缘关系最近。本研究为该毒株的生物学特性以及致病机制研究奠定了基础。

蛋鸡J亚群禽白血病的分子生物学诊断

根据J亚群白血病病毒(ALV-J)原型株HPRS-103的序列设计了一对针对外源性ALV-J引物H5和H7,从发生ML病死鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏和输卵管组织中提取DNA作为模板,经PCR扩增得到长度为545bp的片段,对其序列进行测定后,与ALV-J原型株HPRS-103的序列进行了比较,发现其核苷酸同源性为97.4%,所编码氨基酸的同源性为96.1%。该片段含有ALV-Jgp85编码基因的部分序列和ALV-Jpol基因的部分序列,从分子水平上证实了蛋鸡发生J亚群禽白血病,进一步证明了此前根据病理学观察、免疫组化及免疫荧光诊断的结果。这是首次从分子水平上证明蛋用型鸡发生J亚群禽白血病。

三黄鸡临床多发性肿瘤相关的J亚群禽白血病病毒的分离鉴定及其病理学观察

为研究蛋鸡多发性肿瘤的病因,本实验对病鸡肿瘤组织进行病毒分离、培养及PCR检测,均扩增出针对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)gp85基因序列的阳性条带;组织病理学观察显示发病鸡呈现髓细胞瘤、血管瘤以及纤维肉瘤等多发性肿瘤的病理变化;肿瘤细胞通过血液转移、浸润,在肝和脾组织形成局灶性或弥漫性肿瘤病灶。免疫组化染色显示肿瘤组织内,部分肿瘤细胞呈现阳性反应,表明只有部分肿瘤细胞存在ALV-J感染,而大部分肿瘤细胞检测结果呈阴性。这些病毒检测为阴性的肿瘤细胞可能是正常细胞转化为肿瘤细胞大量克隆化增殖的结果。

广西麻鸡感染A亚群与J亚群禽白血病病毒的诊断

对疑似患有禽白血病的广西麻鸡进行病理剖检、接种DF-1细胞进行病毒分离以及对细胞培养上清进行p27抗原检测、细胞培养物进行PCR扩增,并对分离到病毒的gp85基因进行测序和分析比较。结果表明,从该病鸡同时分离到了A亚群禽白血病病毒（ALV-A）与J亚群禽白血病病毒（ALV-J）,分别命名为ZS14-A株、ZS14-J株。对ALV-A gp85、ALV-J gp85基因的遗传变异分析结果显示,ZS14-A与6株国内外A亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为86.3%~87.8%,其中与国外株MAV-1同源性最高,为87.8%。ZS14-J与7株国内外J亚群参考毒株之间的氨基酸同源性为83.4%~96.1%,其中与J亚群原型株HPRS103同源性最高,为96.1%。

蛋鸡J亚群禽白血病病毒3′非编码区序列特征分析

蛋用型鸡虽在试验条件下可以感染ALV-J,但自然感染时很少引起发病。然而,近年来在中国蛋鸡群中ALV-J发病严重,本研究对2008年以来ALV-J蛋鸡分离株的3′非编码区(3′UTR)进行了系统的分析。结果表明,89.5%(17/19)的ALV-J蛋鸡分离株的3′UTR出现了205bp的缺失,94.7%(16/17)ALV-J蛋鸡分离株保留了完整的E元件。84.2%(16/19)的ALV-J蛋鸡分离株的U3区序列与肉鸡分离株的相似性低于92.5%,所有转录调控元件高度保守。ALV-J蛋鸡分离株的E元件和U3区均出现了多个碱基的突变。这些结果表明,ALV-J蛋鸡分离株的E元件和U3区正在迅速的演化,明显不同于肉鸡分离株的序列特征。这些发现有助于更好地了解ALV-J引起蛋鸡群发病的致病机理。

三黄鸡临床血管瘤病例中分离出A亚群与J亚群禽白血病病毒

为了解禽白血病病毒在广西鸡群中流行情况,采用DF-1细胞接种、细胞培养上清p27抗原检测、PCR扩增,对临床血管瘤型禽白血病的三黄鸡病料进行了病毒分离,并对分离病毒gp85基因进行测序和序列比较。结果表明,从1只病鸡同时分离到了一株A亚群禽白血病病毒（ALV-A）与一株J亚群禽白血病病毒（ALV-J）,分别命名为HG01-A株和HG01-J株。ALV-A gp85与7株A亚群氨基酸同源性为85.8%-87.5%,与A亚群美国株MQNCSU同源性最高为87.5%,与A亚群原型株RSA同源性为86.9%。而ALV-J gp85与7株毒株核酸序列同源性为84.0%-93.8%,与广东株XX2-08以及四川株SCSM01同源性最高为93.8%,与英国原型株HPRS103同源性为90.2%。进化分析进一步表明,HG01-A与各参考株亲缘关系较远,HG01-J与SCSM01亲缘关系最近。本研究首次从同一只广西三黄鸡中同时分离到ALV-A及ALV-J,进一步完善了我国地方品种鸡群中禽白血病的流行病学信息。

我国2000～2001年J亚群禽白血病病毒分离株gp85基因的序列比较

以相当于 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)原型株 HPRS- 10 3基因组碱基 #5 394～ #5 416及 #7811～ #7794的 1对引物做 PCR,在 2 0 0 0～ 2 0 0 1年从山东、河南和宁夏分离的 8株 AL V- J中 ,有 6株可以扩增出含 gp85基因的 2 .2 kb左右的特异性片段。对其中 5株的扩增片段做了序列分析 ,结果表明 ,这 5个毒株的囊膜糖蛋白 gp85与原型株 HPRS-10 3有 93.4%～ 96 .8%的同源性 ,与我国最早的分离株 SD990 2有 93.7%～ 98.7%的同源性 ,它们相互之间的同源性为 91.2 %～ 98.7%。由此说明 ,我国 AL V- J的 gp85基因正在不断发生变异。

安徽省鸡J亚群禽白血病血清学调查

J亚群禽白血病（AL-J）是由J亚群禽白血病病毒（ALV-j）引起的以骨髓细胞瘤为特征的鸡的种源性传染病。该病最早由Payne等从英国的白羽肉鸡中发现，很快传遍全世界几乎所有的白羽肉用型鸡群。我国由于引种将本病带人，1999年杜岩等首次报道从我国的商品肉鸡中检出ALV-j感染。随后ALV-j在全国各地发生的报道日渐增多，不但是肉用型鸡，

J亚群禽白血病病毒gp85基因的原核表达及间接ELISA方法建立

为建立检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)抗体间接ELISA方法,本实验根据已发表的ALV-J gp85基因序列设计一对特异性引物,以该病毒cDNA为模板进行PCR扩增,将目的基因克隆于pET-28a(+)载体中,原核表达的重组蛋白约为38 ku,经western blot分析表明,重组蛋白gp85具有良好的反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA抗体检测方法,该方法对其它相关的禽类病原无交叉反应,其组内和组间的变异系数均低于13%,具有良好的重复性。对458份临床血清样品进行检测,同时用IDEXX的同类ELISA抗体检测试剂盒进行对比,总符合率达到96.29%。本研究为ALV-J的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。

采用SP法检测商品蛋鸡感染J亚群禽白血病病毒对产蛋性能的影响

本研究属世界上首次报道J亚群禽白血病病毒感染对蛋鸡产蛋性能的影响。尸体剖检观察到产蛋鸡的生殖系统发育不良,表现为卵巢、输卵管幼稚型,输卵管粗细不均。组织病理学观察,发现卵巢组织中有大量的胞浆内充满球形嗜酸性颗粒的骨髓瘤细胞。用特异性抗J亚群禽白血病病毒(ALV-J)囊膜糖蛋白gp85的单克隆抗体检测不产蛋鸡的卵巢、输卵管等待检的组织切片,均检出病毒阳性抗原。结果表明ALV-J的感染造成产蛋鸡卵巢、输卵管发育不良,是蛋鸡不产蛋的直接原因。