猪源2型链球菌福建株cps2j基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌cps基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株(SS2PFJ07)DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测cps2j基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下:应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg细菌DNA;SS2PFJ07cps2j基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%～100%和97.8%～100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌cps2j基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测;序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。

2型猪链球菌河南株cps2J基因的遗传进化关系分析

从河南某猪场断奶仔猪发生疫情的病死猪脑脊液中分离到一株细菌,经革兰氏染色初步确定为猪链球菌,应用PCR方法扩增猪链球菌谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,gdh)和荚膜多糖基因(capsular polysaccharide,cps)进行猪链球菌及血清型鉴定,将阳性产物测序,并进行序列比较分析。结果表明,该分离株为2型猪链球菌,与参考菌株同源性在98%以上,其cps2J基因与人源致病性猪链球菌同源性达99.6%。

猪链球菌2型荚膜多糖cps2J基因的克隆与原核表达

利用PCR方法从猪链球菌2型(SS2)四川资阳分离株449-1扩增出cps2J基因,克隆到pMD18-T载体,经酶切与表达质粒pMAL-p2x构建重组表达质粒pMALp2x-cps2J,转化至宿主菌TB1中诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组菌株表达出了约80ku的可溶性目的蛋白MBP-cps2J,约占菌体蛋白总量的13.5%。表达蛋白用Amylose树脂层析柱纯化,将纯化的融合蛋白MBP-cps2J免疫家兔制备抗血清,经ELISA和协同凝集试验检测,其与SS2呈特异性阳性反应。

浙江省9株猪链球菌2型分离株Cps2J全基因克隆与序列分析

目的了解浙江猪链球菌2型(SS2)分离株的分子基础及与国内外其他分离株的基因差异程度,确定Cps2J基因变异位点和频率,为该地区的猪链球菌防治提供科学依据。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后采用ABI自动测序仪测定序列,并同国内外其他分离株的基因进行比较。结果扩增出9株菌株的Cps2J基因的完整开放阅读框(ORF)都为999bp,编码333个氨基酸,9株菌株Cps2J片段核苷酸高度同源,同源性在99.7%～100%;与国内外其他的SS2核苷酸的同源性为98.8%～99.0%,与猪链球菌1型的同源性只有56.8%～57.0%。结论9株浙江省猪链球菌2型分离株Cps2J基因序列非常保守,这些不同来源的菌株可能有相同的起源。

3株人源猪链球菌2型湖南株cps2J、gdh、ef基因进化分析

目的对3株人源猪链球菌2型(S.suis 2)湖南株(HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102)cps2J、gdh、ef基因进行序列测定和进化分析,了解其变异和进化状况,为人感染S.suis疫情的防控提供数据。方法设计S.suis 2 cps2J、gdh、ef基因PCR引物,对HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株进行PCR扩增和序列测定,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行分析。结果 cps2J、gdh、ef基因包含的完整开放阅读框(ORF)分别为999bp、1 347bp、2 532bp,分别编码333、448、843个氨基酸。在线BLAST同源性分析表明,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株属于S.suis 2,3菌株cps2J、gdh、ef基因组序列之间的核苷酸同源性均为100%;进化树显示,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株与国内外猪源和人源S.suis 2菌株属于同一分支,同源性比较显示3株S.suis 2湖南分离株cps2J、gdh、ef基因与其他国内外S.suis株核苷酸序列同源性分别为99.8%～100%、96.4%～100%和99.7%～100%,氨基酸同源性分别为98.5%～100%、98.7%～100%和99.5%～100%。结论 3株人源S.suis 2湖南株cps2J、gdh、ef基因序列与国内外S.suis 2菌株相应基因序列同源性高,变异程度小。

异源表达酸土脂环酸芽孢杆菌DnaJ基因提高大肠杆菌胁迫抗性

构建重组质粒p ET28a-Dna J,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导重组大肠杆菌表达酸土脂环酸芽孢杆菌Dna J,对重组大肠杆菌和对照大肠杆菌分别进行热及酸、碱胁迫处理,研究酸土脂环酸芽孢杆菌Dna J基因异源表达对重组大肠杆菌胁迫抗性的影响。试验结果表明,经过热、酸胁迫后,重组大肠杆菌的存活率明显高于对照菌株,而在碱胁迫条件下,两种菌株的存活率相差不大,说明酸土脂环酸芽孢杆菌Dna J基因在大肠杆菌中异源表达能显著提高宿主菌对高温及酸胁迫的抗性,为发酵工业生产中构建高产抗逆工程菌株提供基因素材和理论依据。

牛胚系基因中两种JH和Cμ抗体基因的克隆与分析

根据NCBIGenBankTM中登录的2个牛抗体重链可变区J基因(JH)(序列号为AY158087,AY149283)的序列不同之处设计PCR引物,能从同一个体的Holstein牛基因组DNA中扩增得到与以上2个基因分别相同的序列,证明这2个JH基因的差异不是由于牛个体或品种不同引起的.提取牛脾脏总RNA,RT-PCR扩增IgMcDNA,测序结果显示:序列号为AY149283的JH基因中第六外显子JH6是一个功能基因,它可以编码牛IgM的部分CDR3区和完整的FR4区,从2种IgMcDNA克隆的测序结果可以看出,其恒定区序列分别与序列号为U63637和AY230207的2种抗体重链恒定区μ基因(Cμ)cDNA序列相同.PCR扩增JH-Cμ序列,测序结果表明:序列号为AY158087的JH基因是同以上2种Cμ基因分别串连在一起的(序列号分别为AY230207和U63637).以上结果证明:序列号为U63637和AY230207的2个Cμ基因分别与AY149283的JH基因串联在一起,都能够参与牛IgM的产生,它们与AY158087的JH基因共同存在于同一个体Holstein牛胚系基因中.

转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立

目的建立针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J163品系特异性实时荧光(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测方法。方法利用Taq Man实时荧光PCR(real-time PCR)技术,根据转基因苜蓿草品系J163 5’端外源插入片段P-e FMV与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物和探针,建立了转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度及可重复性进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J163成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为15 pg,相当于9拷贝转基因苜蓿草J163基因组DNA,重复性试验显示,其标准偏差(Standard deviation,SD)和相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均在可接受范围内。结论本研究建立的转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析。

转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测方法的建立

目的建立针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草品系J163品系特异性等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。方法根据转基因苜蓿草品系J163 5’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计6条引物,建立了转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J163成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为16 pg,相当于10拷贝转基因苜蓿草J163基因组DNA。结论本研究建立的转基因苜蓿草J163品系特异性LAMP检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J163成分进行检测分析。

可视化LAMP法快速检测转基因苜蓿草J101品系

目的建立我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的转基因苜蓿草J101品系特异性环介导等温扩增(loop–mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。方法根据转基因苜蓿草品系J101 3’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计6条引物,建立转基因苜蓿草J101品系特异性LAMP检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J101成分检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为16 pg,相当于10拷贝转基因苜蓿草J101基因组DNA。结论本研究建立的转基因苜蓿草J101品系特异性LAMP检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确、稳定地对转基因苜蓿草J101成分进行检测分析。

转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测方法的建立

目的建立转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测方法。方法根据转基因苜蓿草品系J101 5’端外源插入片段与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列设计引物,建立了转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测方法,并对本方法的特异性、灵敏度进行了测定。结果建立的检测方法特异于转基因苜蓿草J101检测,检测最低DNA浓度为(1imit of detection,LOD)为80 pg,相当于50拷贝转基因苜蓿草J101基因组DNA。结论本研究建立的转基因苜蓿草J101品系特异性定性PCR检测方法特异性好,灵敏度高,能够快速、准确地对转基因苜蓿草J101进行检测分析。

不同非洲猪瘟病毒株j5R基因及其编码蛋白的比较

根据非洲猪瘟病毒ＭａｌａｗｉＬＩＬ２０／１株ｊ５Ｒ阅读框Ｃ端抗原决定簇序列制备的合成肽能被不同毒株感染康复猪的免疫血清识别。多聚酶链反应研究表明，９个不同毒株的ｊ５Ｒ基因长度略有差异；蛋白转印杂交试验证明，这种基因长度的差异导致相应蛋白多肽的长度多样性。这些结果进一步证明，长度多样性是非洲猪瘟病毒基因及其编码蛋白较为普遍的特点。

中国汉族人CYP2J2基因外显子8等位基因多态性研究

目的 探讨中国汉族人CYP2J2基因外显子 8等位基因是否存在基因多态性改变及其与原发性高血压的关系。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)和限制性片段分析 ,随机对 15 0例汉族健康体检者及 15 0例汉族原发性高血压患者进行CYP2J2基因外显子 8位点进行多态性分析。结果 30 0例均为野生型 ,未发现杂合子或纯合子。结论 未发现中国汉族人CYP2J2基因外显子 8等位基因突变 ,中国汉族人高血压可能与CYP2J2基因外显子 8等位基因突变导致的氨基酸改变引起的AA代谢异常无关。

J亚群禽白血病Hrb-1分离株env基因克隆及gp85杆状病毒表达载体的构建

自哈尔滨某送检患病鸡群中分离出一株病毒,经RT＿PCR检测、SPF鸡胚成纤维细胞增殖后,获取其前病毒DNA,采用依据原型毒株HPRS＿103cDNA序列设计并合成的一对引物,PCR扩增病毒的囊膜基因,连接pMD18＿T载体并转化大肠杆菌JM109,培养后提取质粒分别用HindIII,BamHI进行单酶切和双酶切鉴定,得到了阳性重组质粒pMD18＿T＿Hrb＿1/env,对其进行PstI酶切,回收包含J亚群禽白血病病毒株Hrb＿1gp85基因的997bp片段,应用BactoBac杆状病毒表达系统,将外源片段与线性化的杆状病毒载体pFastBacHTA进行连接,获得重组载体pFASTBacHTA/gp85,将该重组载体转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得了杆状病毒重组载体Bacmid/gp85,为表达gp85并建立适于国内应用的ELISA诊断方法奠定了基础。

研究Cyp2j3基因对H9C2大鼠心肌细胞保护作用以及相关机制

目的探讨Cyp2j3基因通过STAT3信号通路对H9C2心肌细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 H9C2大鼠心肌细胞分为正常对照组(对照组,常氧条件下培养)、pc DNA3.1组(转染空载体pcDNA3.1)、单纯缺氧复氧组(I/R+pcDNA3.1组,转染pc DNA3.1后,缺氧10 h后复氧2 h)和单纯缺氧复氧+pc DNA3.1-Cyp2j3组转染Cyp2j3的过表达载体后,缺氧10 h后复氧2 h)。Western bloting检测过表达Cyp2j3的效果;噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞活力;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞的LDH活性;流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;Western bloting检测增殖相关蛋白Ki67、凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及信号转导与转录因子3(STAT3)信号通路STAT3和磷酸化的STAT3的蛋白表达。结果转染pc DNA3.1-Cyp2j3后的H9C2细胞Cyp2j3的蛋白表达显著升高;I/R+pc DNA3.1组和I/R+pcDNA3.1-Cyp2j3组细胞的OD值及Ki67、Bcl-2和pSTAT3的蛋白表达均显著低于pcDNA3.1组,LDH活性、细胞凋亡率及Caspase3蛋白表达均显著高于pcDNA3.1组(P<0.05),而I/R+pc DNA3.1-Cyp2j3组细胞的OD值及Ki67、Bcl-2和p-STAT3的蛋白表达均显著高于I/R+pc DNA3.1组,LDH活性、细胞凋亡率及Caspase3蛋白表达均显著低于I/R+pcDNA3.1组(P<0.05)。结论过表达Cyp2j3基因可通过激活STAT3信号减弱缺氧复氧引起的H9C2细胞增殖降低、LDH活性和凋亡增加,从而对心肌细胞起保护作用。

小鼠CYP2J5基因组织差异表达及蛋白质结构与功能分析

为探讨小鼠CYP2J5的结构特征及生物学功能,首先通过实时荧光定量PCR分析了小鼠CYP2J5基因组织差异表达,然后采用生物信息学工具进行了CYP2J5蛋白质结构与功能的预测和分析;为进一步探索和验证CYP2J5生物学功能及对脂代谢和性激素合成的影响,基于基因工程技术构建CYP2J5基因的超表达载体,并通过Western Blot确认构建的载体能正确表达CYP2J5基因。最终将构建的CYP2J5超表达载体导入小鼠TM3细胞,通过qPCR分析了脂代谢和性激素合成相关基因表达。结果显示,小鼠CYP2J5基因在肝脏和肾脏中高水平表达,该基因属可溶性胞质蛋白质,蛋白质二、三级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,有信号肽存在并在第13~35及75~97个氨基酸之间存在跨膜区,其主要功能是参与细胞脂代谢和脂肪酸代谢等生物调节过程。在TM3细胞中超表达CYP2J5基因后,脂代谢与性激素通路关键基因有显著变化。结果为CYP2J5基因功能的研究与开发利用提供了生物信息学和分子生物学方面的基础数据。

Fox j1基因多态性与朝鲜族人群哮喘易感性的相关性

[目的]检测朝鲜族人群Forkhead-box j1(Fox j1)基因的3个单核苷酸多态性(SNP)位点g.-460C>T,g.1805G>T,g.3375G>C的多态性,观察其与朝鲜族人群支气管哮喘易感性的关系.[方法]采用聚合酶链反应法和直接测定序列法检测32例朝鲜族哮喘患者和50例正常对照者的Fox j1基因的单核苷酸多态位点g.-460C>T,g.1805G>T,g.3375G>C的基因型,计算基因型频率和等位基因频率,进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验,并对比分析两组等位基因频率和基因型频率分布.[结果]Fox j1基因所选择的3个SNP位点在朝鲜族人群中均具有多态性,其基因型频率和等位基因频率分布在哮喘组和对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡.哮喘组上述位点的基因型频率和等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05).[结论]未发现Fox j1基因的g.-460C>T,g.1805G>T,g.3375G>C的多态性与朝鲜族人群支气管哮喘易感性有显著相关性.

延边地区朝鲜族ADP-核糖基化样因子15基因和内向整流通道蛋白J亚单位11号成员基因的基因单核苷酸多态与2型糖尿病的相关性

[目的]探讨ADP-核糖基化样因子15基因(ARL15)和内向整流通道蛋白J亚单位11号成员基因(KCNJ11)的单核苷酸多态(SNP)位点rs26770、rs5219与延边地区朝鲜族2型糖尿病(T2DM)的相关性.[方法]采用病例对照设计,选择延边地区朝鲜族307例,其中T2DM患者255例、糖耐量正常(NGT)人52例.利用单碱基延伸方法检测rs26770、rs5219的基因型.[结果]在显性遗传模型中,T2DM组KCNJ11基因携带rs5219位点的TT+CT基因型频率显著高于NGT组(P=0.001,OR=2.917, 95%CI:1.531~5.558);2个SNPs联合作用结果显示,T2DM组携带AA-CC和AG-CC联合基因型明显小于NGT组(P=0.008,OR=0.320, 95%CI:0.133~0.770;P=0.012,OR=0.357,95%CI:0.156~0.817).[结论]KCNJ11基因rs5219-T可能是延边地区朝鲜族人群罹患T2DM的易感因子,而携带KCNJ11和ARL15基因SNPs rs26770、rs5219的联合基因型AA-CC和AG-CC可能具有保护健康人群罹患T2DM的作用.

转基因苜蓿J163品系定性标准样品的研制

研究目的:研制转基因苜蓿J163品系的基体定性标准样品,从而提高转基因苜蓿J163品系检测的科学性和一致性。方法:将经PCR方法验证的转基因J163品系苜蓿种子作为候选物,通过研磨、过筛、搅拌、冷冻抽干制备得到定性标准样品,分装后进行均匀性和稳定性检验,并联合8家外部实验室对标准样品进行了定值。结果:经8家权威实验室协同定值验证,PCR检测的结果判定均为转基因苜蓿J163品系阳性,与研制单位的检测结果相一致。结论:制备的标准样品均匀性和稳定性均达到了国家标准样品的技术要求,可用于转基因苜蓿J163品系分子检测技术的质量控制、检测试剂的验证和评价。