嗜水气单胞菌J-1株粘附素及其受体分析

以EPC细胞和HEp 2细胞为细胞模型 ,用嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila ,Ah)J 1株进行粘附试验 ,同时以Ah4型菌毛的抗血清作粘附抑制试验 ,用以分析AhJ 1株的粘附素及其受体。EPC细胞粘附和粘附抑制试验证实 ,AhJ 1株粘附素受体具有甘露糖、胆固醇成分 ,有少量半乳糖成分 ,无葡萄糖成分。HEp 2细胞粘附和粘附抑制试验证实 ,与其它非菌毛粘附素如S层及外膜蛋白相比 ,Ah 4型菌毛的粘附作用较为显著。抗 4型菌毛抗体抑制细菌的粘附力达 80 %以上。抗S层、外膜蛋白抗体也能使细菌的粘附力下降 ,表明Ah的粘附作用由菌毛粘附素与非菌毛粘附素共同参与。

嗜水气单胞菌J-1株丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列,设计和合成了一对引物,以嗜水气单胞菌AhJ-1的基因组DNA为模板,通过PCR技术,扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段,并克隆到质粒载体pGEM-T中进行测序和分析,结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％,扩增片段编码343个氮基酸,推测的分子量为35700,计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性,可作为核酸疫苗的侯选基因片段。

嗜水气单胞菌J-1株弹性蛋白酶的表达、纯化及特性分析(英文)

【目的】表达、纯化嗜水气单胞菌J-1株弹性蛋白酶,并对弹性蛋白酶的性质进行分析。【方法】以pET-32a为表达载体将弹性蛋白酶基因ahyB转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,表达重组酶用HisTaqNi2+亲和层析柱纯化并用6mol/L盐酸胍进行复性;利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析对嗜水气单胞菌培养上清液中的弹性蛋白酶进行纯化。【结果】从嗜水气单胞菌培养上清液中获得的弹性蛋白酶原酶的最适pH为8.5,而表达重组酶为10.0;对热的稳定性,原酶高于表达酶。两种形式酶的性质有一些相似性,其酶活性都能被EDTA、OPA金属蛋白酶抑制剂抑制,而表达酶对抑制剂的耐受性要高于原酶。金属离子Zn2+、Fe2+能抑制酶的活性。【结论】两种形式的弹性蛋白酶均属于Zn2+/Fe2+型金属蛋白酶,且具有相似的酶学性质。本研究为弹性蛋白酶酶学反应机制的深入研究及其应用奠定了基础。

嗜水气单胞菌J-1株外膜蛋白Omp38的抗原性分析

根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白Omp38的基因序列设计引物,以Ah J-1株基因组为模板,扩增omp38基因片段,定向克隆至表达质粒pET32 a中,将重组原核表达质粒pET32 a-omp38转化至大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量约35 ku的重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA检测抗体效价为1∶25 600,表明该蛋白有良好的免疫原性。PCR检测表明,omp38基因可在73%(22/30)的嗜水气单胞菌中发现。重组蛋白抗血清与30株嗜水气单胞菌分离株进行凝集试验,所有分离株均可在不同程度上发生反应,表明该重组蛋白是一种潜在的共同保护性抗原,可作为基因工程亚单位疫苗的候选成分。

筛选用转座子Tn916诱变的具有免疫原性的嗜水气单胞菌蛋白酶缺失株

以携带质粒pAM120(Ap^t、Tc^t／Tn916)的大肠杆菌(Ecoli)CG120株为供体菌，与受体菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)J-1株，采用滤膜接合法进行接合转移，在选择平板(含Tc、cfz和脱脂奶)上进行筛选，筛选出6株蛋白酶缺失株(ECPase)，ECPase菌株其生长速度，对正常鲫鱼血清的抗性降低，用脱脂奶平板法及底物法检测，蛋白酶产量明显降低。与亲本J-1株相比，突变株致病力降低．对鲫鱼的半数致死量大于10^8(J-1株对鲫鱼的半数致死量为5×10^3)。用ECPase突变株MJ-1株的18h培养物(5×10^6CFU)接种健康鲫鱼，不产生亲本J-1株引起的病变及死亡。用MJ-1活菌免疫鲫鱼，在第5周产生较高的凝集抗体，且对强毒株J-1的攻击有保护作用。表明蛋白酶是嗜水气单胞菌的一个重要的毒力因子。ECPase突变株仍具有免疫原性。