葡萄VvJAZ9蛋白原核表达与多克隆抗体制备

JAZ蛋白是茉莉酸(JA)信号调控途径中的重要组分,也是调节JA参与植物生长发育以及逆境应答的关键因子。JAZ9基因是编码TIFY家族JAZs蛋白的基因之一。为研究欧洲葡萄VvJAZ9蛋白参与低温胁迫的功能,本试验以欧洲葡萄霞多丽叶片为研究材料,通过同源克隆获得了VvJAZ9基因序列,其全长807 bp,编码268个氨基酸,定位于第11条染色体,有5个外显子和4个内含子;VvJAZ9蛋白具有JAZs家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和CCT_2结构域,与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明,VvJAZ9基因在低温处理1~24 h后表达量呈上升趋势,在24 h表达量最高。亚细胞定位结果证实VvJAZ9定位于细胞核。将VvJAZ9的开放阅读框(ORF)序列克隆至原核表达载体pET28b上,在大肠杆菌(E.coli BL21)中经37℃、1.0 mmol·L^(-1)异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得VvJAZ9-His融合蛋白,再经抗原免疫,血清纯化后制备anti-VvJAZ9兔源多克隆抗体。蛋白免疫印迹(Western Blot)结果表明,anti-VvJAZ9抗体可以特异性识别葡萄内源的JAZ9蛋白、VvJAZ9-MYC融合蛋白以及VvJAZ9-GFP融合蛋白等不同形式的JAZ9蛋白;同时,10μmol·L^(-1)MeJA处理下葡萄原生质体中JAZ9蛋白表达水平呈下降趋势。综上,本研究结果为葡萄VvJAZ9基因的生物学功能研究提供了基础。