沉默miR-31-5p抑制口腔鳞状细胞癌的增殖及凋亡

目的探究miR-31-5p对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖和凋亡的作用及与线粒体活性之间的关系。方法RT-qPCR检测OSCC组织和细胞中miR-31-5p的表达。利用Lipofectamine 2000将miR-NC、miR-31-5p mimic、miR-31-5p inhibitor分别转染至SCC-25和CAL-27细胞内,将细胞分为Control组、miR-NC组、miR-31-5p inhibitor组和miR-31-5p mimic组。克隆形成实验检测细胞增殖,微管形成实验检测微管数目,流式细胞术检测细胞凋亡,JC-1染色评估线粒体活性,ELISA检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;蛋白印迹法检测Ki67、survivin、VEGF、Bcl-2、Bax和c-Myc蛋白表达水平。结果RT-qPCR检测结果显示,miR-31-5p在OSCC组织和细胞中均高表达(P<0.05);与Control组比较,沉默miR-31-5p可显著降低SCC-25和CAL-27细胞克隆形成和微管形成数目(P<0.05),并提高细胞凋亡率(P<0.05);蛋白印迹实验结果表明,沉默miR-31-5p可降低Ki67、survivin、VEGF和c-Myc蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比率(P<0.05)。沉默miR-31-5p可显著降低SCC-25和CAL-27细胞中JC-1线粒体活性(P<0.05),抑制SOD活性并增加MDA含量(P<0.05)。结论沉默miR-31-5p通过破坏线粒体活性抑制OSCC细胞的增殖并诱导其凋亡。

地塞米松影响小鼠胸腺细胞线粒体膜电势变化研究

目的研究地塞米松刺激小鼠胸腺细胞过程中线粒体膜电势(△Ψm)的变化。方法以终浓度1×10-6mol/L地塞米松(DEX)刺激小鼠胸腺细胞,通过JC-1染色流式细胞术,在0、1、3、5、7、9、11、24和27h时点分别检测小鼠胸腺细胞平均J-aggregate(FL2)和平均J-monomer(FL1)含量,并计算线粒体膜电势(FL2/FL1)。结果本研究中,小鼠胸腺细胞离体后FL1所反映的线粒体质量迅速下降,至5h对照组达到平台期(913.38±70.11),然后缓慢下降到27h的(622.80±22.81)。DEX组FL1在1h和3h与对照组没有显著差异(P>0.05),而从5h(660.91±72.95)开始显著低于对照组(P<0.01),并且随培养时间延长呈下降趋势,至27h的(309.70±53.35)。对照组和DEX组FL2随培养时间延长而降低。1-9h,对照组和DEX的△Ψm没有显著差异(P>0.05)。而在11、24和27h,对照组△Ψm分别为(256.41±21.59)、(214.14±23.21)和(146.14±17.97),而DEX组△Ψm显著低于对照组(P<0.01),分别为(138.28±20.59)、(111.61±29.67)和(72.92±17.86)。结论DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中,线粒体质量降低和△Ψm下降是早期事件,而细胞内现存线粒体△Ψm下降则是较晚期的事件。在本研究中,线粒体质量下降与现存线粒体膜电势的变化之间关系不紧密。

牛孤雌胚胎发育过程中泛素定位与线粒体分布的相关性

【目的】研究泛素(Ub)在牛孤雌胚胎发育过程中的表达定位及与荧光标记线粒体分布的关联性。【方法】将人工合成Ub基因插入真核表达载体pVenus的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pVenus-Ub,采用脂质体2000介导重组质粒pVenus-Ub转染Hela细胞,经荧光显微镜观察和PCR检测,探讨重组质粒pVenus-Ub在Hela细胞中的表达情况;用体外转录试剂盒将pVenus-Ub转录为cRNA并注射牛卵母细胞,选择成熟卵母细胞并将其经离子霉素孤雌激活后,在荧光显微镜下观察Ub的表达和定位情况;同时,用JC-1荧光染料对牛卵母细胞线粒体进行染色,观察线粒体的分布,探讨Ub定位与线粒体分布的相关性。【结果】重组载体pVenus-Ub能在Hela细胞中表达;Ub蛋白在牛体外成熟卵母细胞及孤雌发育过程中均有表达,分布于整个胞质中,并在皮质及核区分布较集中;成熟卵母细胞及早期孤雌胚胎中Ub蛋白与线粒体共定位。【结论】成功建立了Ub基因的真核表达体系及孤雌胚胎表达体系,且在牛孤雌胚胎发育过程中Ub的定位及与线粒体的分布相互关联。