RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达

目的:以人类白细胞抗原G基因(HLA-G)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达。方法:针对HLA-G基因设计一段小干扰RNA(siRNA),由Ambion公司化学合成,用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR、流式细胞术和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HLA-G表达的影响。结果:针对HLA-G的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HLA-G的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HLA-G基因的表达,为进一步研究HLA-G在人类的母胎免疫耐受、正常妊娠的维持及助孕技术应用等方面的作用奠定了实验基础。

人绒毛膜促性腺激素诱导JEG-3细胞TGF-β_3的表达

目的:探讨人绒毛膜促性腺激素（hCG）对绒癌细胞系表达转化生长因子（TGF-β3）的影响。方法:以绒癌细胞来源的JEG-3细胞系为研究对象,采用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）方法,观察HCG对JEG-3细胞表达TGF-β3 mRNA的影响响。结果:分别用0、50、500、5000、25000 mU/ml hCG处理48h后,JEG-3细胞中TGF-β3 mRNA的含量逐渐被诱导增多,并表现出一定的浓度效应——随hCG作用浓度增高而显著;另外,分别检测受25 000mU/ml hCG处理0、6、12、24、30、36、48h的JEG-3细胞中TGF-β3 mRNA的表达情况,发现TGF-β3表达受hCG的诱导在30h时最强,之后逐渐减弱。结论:hCG可能通过调节TGF-β3在滋养细胞或滋养细胞来源的绒癌细胞中的表达,进而影响细胞的浸润转移。

转化生长因子-β_1对绒癌JEG-3细胞MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达的影响

目的探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)不同浓度和作用时间对绒癌JEG-3细胞基质金属蛋白酶-9基因(MMP-9 mRNA)及基质金属蛋白酶抑制剂-1基因(TIMP-1 mRNA)表达的影响。方法先分别用TGF-β10、100、200 ng/ml作用于绒癌JEG-3细胞,48 h收获细胞;再以TGF-β1100 ng/ml分别与JEG-3细胞作用0、12、24、48、72h;最后用RT-PCR技术检测TGF-β1不同浓度和作用时间收获JEG-3细胞的MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达。结果随TGF-β1浓度升高和作用时间延长,各收获细胞的MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达均明显升高,且MMP-9 mRNA与TIMP-1 mRNA比值均>1(P<0.01或<0.05)。结论在一定浓度和作用时间内,外源性TGF-β1可促进绒癌JEG-3细胞MMP-9 mRNA及TIMP-1 mRNA表达。

人绒毛膜促性腺激素对JEG-3细胞表达VEGF的影响

目的 :揭示人绒毛膜促性腺激素 (hCG)对滋养层细胞表达血管内皮生长因子 (VEGF)的影响。方法 :以滋养层细胞来源的JEG - 3细胞系为研究对象 ,采用半定量逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)方法检测VEGFmRNA的表达。结果 :分别用 (0、50、50 0、5 0 0 0、2 5 0 0 0 )U/LhCG处理 48h后 ,JEG - 3细胞中VEGF的表达被诱导增高 ,且包括VEGF1 2 1 、VEGF1 6 5、VEGF1 89在内的VEGF亚型均受到诱导。另外 ,观察VEGF在 2 5 0 0 0U/LhCG处理的JEG - 3细胞中表达的时间变化 ,结果发现VEGF在JEG - 3细胞中的表达在经过短暂的诱导后略降低。结论 :hCG可能通过调节VEGF在滋养层细胞或滋养层细胞来源的绒癌细胞中的表达 ,进而影响细胞的增殖。

不同剂量IL-12对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖的影响

目的观察不同剂量白细胞介素-12(IL-12)对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖能力的影响。方法体外培养人绒毛膜癌JEG-3细胞,分别给予不同剂量的IL-12进行诱导,四甲基氮唑(MTT)比色法检测细胞增殖能力的变化。结果 5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml IL-12作用后,细胞增殖率显著降低(P<0.01)。且绒毛膜癌JEG-3细胞对IL-12的诱导作用表现为良好的浓度效应。结论外源性IL-12能够抑制绒毛膜癌JEG-3细胞的增殖,具有良好的浓度依赖效应。其相关机制有待进一步探讨。

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HMGA1的表达

目的:以人类高迁移率蛋白A1(HMGA1)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HMGA1的表达。方法:针对HMGA1基因设计、合成一段小干扰RNA(siRNA),用脂质体lipo-fectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HMGA1表达的影响。结果:针对HMGA1的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HMGA1的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HMGA1基因的表达,为研究HMGA1基因在肿瘤细胞中的作用奠定实验基础,也为进一步研究HMGA1在治疗人类绒毛膜细胞癌的临床应用提供了有益帮助。

17β-雌二醇调节JEG-3细胞的microRNA表达研究

目的:探讨17β-雌二醇(E2)调节人绒毛癌细胞系JEG-3的microRNA的表达.方法:定量PCR检测E2对microRNA的表达.结果E2能够促进JEG-3 miR16、miR126、miR335、miR451、miR491-5p、miR-520g和miR612的表达,降低miR-26b和miR-29b的表达.结论:E2能够对JEG-3细胞的microRNA表达产生调节作用,提示我们在妊娠过程中E2可以通过调节microRNA来影响滋养层细胞增殖、迁移、浸润和血管重塑等功能,并可能为探讨子痫前期等的发病机制提供线索.

IL-6干预后人绒毛膜癌JEG-3细胞侵袭能力及MMP-2表达的变化

目的:观察IL-6干预后人绒毛膜癌JEG-3细胞侵袭能力的变化,并探讨其是否通过STAT3信号通路调控MMPs的表达实现该作用。方法:体外培养JEG-3细胞,实验1分为抑制剂组(5μmol/L STAT3活性抑制剂SD-1008)和空白对照组,处理24 h后,采用Western blot和荧光定量PCR检测2组细胞中p-STAT3蛋白与基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)蛋白和mRNA的表达水平。实验2分为IL-6组(10μg/L IL-6)和空白对照组。采用Western blot检测2组细胞处理10、30、60 min p-STAT3的表达水平,采用MTT实验和Transwell实验检测处理36 h后2组细胞的增殖能力和侵袭能力,同时检测MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA的表达水平。结果:①与空白对照组相比,抑制剂组的p-STAT3蛋白、MMPs mRNA及蛋白水平均下降(P<0.05)。②与空白对照组相比,IL-6组JEG-3细胞的增殖能力无明显改变,但侵袭能力增强(P<0.05),细胞中p-STAT3、MMP-2和MMP-9的表达量差异无统计学意义(P>0.05),但细胞中活化形式的MMP-2蛋白的表达水平升高(P<0.05)。结论:STAT3可能是调控滋养细胞中金属基质蛋白酶表达信号通路中的上游分子;IL-6可通过上调MMP-2的活化水平来促进JEG-3细胞的侵袭能力,但并非通过STAT3信号通路,其机制有待进一步阐明。

转化生长因子-β_1对人绒癌JEG-3细胞增殖及基质金属蛋白酶抑制剂-1的作用研究

目的观察转化生长因子(TGF)-β1不同作用时间对绒癌JEG-3细胞增殖及基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1的影响。方法以100μg/LTGF-β1处理JEG-3细胞,分别于不同时间收获细胞,采用MTT法于0、12、24、48h检测细胞的增殖活力,采用Western Blotting及RT-PCR技术于0、12、24、48、72h分析TIMP-1在蛋白和转录水平的表达情况。结果随着100μg/LTGF-β1作用时间的延长,各实验组的细胞增殖率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05);TIMP-1蛋白和TIMP-1 mRNA的表达随着100μg/LTGF-β1作用时间的延长均呈明显的增加趋势(P<0.05)。结论绒癌JEG-3细胞对外源性的TGF-β1有良好的反应性并呈时间依赖性,100μg/LTGF-β1可促进JEG-3细胞增殖及TIMP-1蛋白及其mRNA的表达。

共表达pcIL-18/MAGE-1 DNA疫苗对JEG-3细胞HLA-G基因表达的影响

目的观察共表达基因疫苗pc IL-18/MAGE-1对绒癌JEG-3细胞株HLA-G基因表达的影响,探究pc IL-18/MAGE-1抗肿瘤作用机制。方法应用构建的共表达pc IL-18/MAGE-1 DNA疫苗免疫小鼠,同时设阴性对照组和空白对照组,免疫后分别收集脾细胞,作用于靶细胞JEG-3,应用FCM检测小鼠T细胞亚群情况及NK细胞活性,MTT法检测肿瘤特异性CTL对靶细胞的杀伤率,RT-PCR法检测HLA-G基因表达情况。结果免疫组HLA-G基因表达降低,且对JEG-3细胞杀伤活性增加,与对照组比较,差异显著(P<0.05)。免疫组NK细胞活性及CD4+/CD8+、CD8+、CD4+值均高于对照组(P<0.05)。结论共表达基因疫苗pc IL-18/MAGE-1通过降低HLA-G基因的表达,进而增加NK细胞活性以及诱导肿瘤特异性CTL直接杀伤肿瘤细胞,发挥抗肿瘤作用。

miR-152影响NK细胞对JEG-3细胞的杀伤效应

目的:研究miR-152分子对NK细胞杀伤JEG-3细胞效应的影响。方法:在滋养细胞肿瘤细胞系JEG-3细胞中分别转染pre-miR-152(实验组),Cy3标记的pre-miRNA-control(阴性对照),空白对照(NC)为未转染的JEG-3细胞。转染48h进行NK细胞的细胞毒测定,观察各组NK细胞对JEG-3细胞的杀伤效应。结果:与对照组相比,实验组NK细胞对JEG-3细胞的平均杀伤率显著增高(P<0.05),且随着效靶比的增高,杀伤率也增大。空白对照组与阴性对照组之间的NK细胞杀伤能力无显著差异(P>0.05)。结论:miR-152可以提高NK细胞对滋养细胞的杀伤作用。

HLA-G短干扰RNA真核表达载体的构建及其在JEG-3细胞株中抑制HLA-G表达的研究

目的:构建HLA-G短干扰RNA表达质粒及探讨HLA-G的功能。方法:根据siRNA设计的原则,结合pSilencer2.1-U6-neo质粒的特点,针对HLA-G基因设计并合成两对寡聚DNA片段,退火后将其克隆入pSilencer2.1-U6-neo,将重组真核表达质粒pSi-lencer2.1-U6-neo-HLA-G采用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株。应用RT-PCR、W estern-blot等方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平;MTT法检测转染后JEG-3细胞增殖的变化。结果:RT-PCR和W estern-blot结果均表明瞬时转染重组pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达。实验组JEG-3细胞生长较对照组明显受到抑制。结论:pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G质粒构建成功,可下调JEG-3细胞中HLG的表达,抑制绒癌细胞生长。

转化生长因子β1作用下绒毛膜癌JEG-3细胞c-myc mRNA表达

目的观察在转化生长因子β1(TGF-β1)、-β1受体Ⅰ抑制剂(LY364947)和p38MAPK抑制剂(SB203580)作用下,绒毛膜癌JEG-3细胞中c-myc mRNA的表达变化。方法用5 ng/ml的TGF-β1以及1μM、3μM TGF受体Ⅰ抑制剂(LY364947)和1μM、3μM p38MAPK抑制剂(SB203580)作用JEG-3细胞,用qRT-PCR技术检测各组细胞中c-myc mRNA的表达差异。结果与正常对照组比较,5 ng/ml TGF-β1组细胞中c-myc mRNA的表达水平升高(P<0.05);p38 MAPK抑制剂(SB203580)和TGF-β受体Ⅰ抑制剂(LY364947)均抑制了c-myc mRNA的表达,且抑制作用与应用浓度呈正相关(P<0.05)。结论 c-myc作为TGFβ1/Smads通路的下游靶基因,其调控有赖于TGFβ1与受体Ⅰ的结合,同时,在绒毛膜癌JEG-3细胞中,TGF-β1介导的Smad途径与p38 MAPK信号转导存在交互作用。

HLA-G基因siRNA真核表达质粒的构建及其对转染JEG-3细胞株HLA-G表达的抑制作用

目的:构建针对人类白细胞抗原-G基因(human leukocyte antigen-G,HLA-G)基因siRNA表达质粒,观察其对转染JEG-3细胞的HLA-G基因表达的抑制作用。方法:选择RNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,通过与线性化pSuppressor-U6-neo连接、转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。将重组真核表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G用脂质体法转染JEG-3绒癌细胞株。应用RT-PCR、Western-blot方法检测转染的JEG-3细胞中HLA-G基因的表达水平。结果:双酶切鉴定及测序图显示,插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。RT-PCR和Western-blot结果均表明瞬时转染重组pSuppressor-U6-neo-HLA-G质粒明显抑制了JEG-3细胞中HLA-G基因的表达。结论:本试验成功构建了针对HLA-G基因的siRNAs表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G,瞬时转染JEG-3细胞后可以明显抑制HLA-G基因的表达。

紫杉醇对绒癌JEG-3细胞增殖与凋亡的影响

目的该文围绕紫杉醇对人绒毛膜癌细胞JEG-3的增殖与凋亡的影响进行研究。方法通过MTT法检测细胞增殖及流式细胞术检测不同浓度紫杉醇作用下细胞的凋亡及其对细胞周期的影响。结果随紫杉醇浓度的增加或时间的延长,JEG-3细胞增殖抑制率及凋亡率均增大,各组间比较有统计学意义(P<0.05)。结论该次实验的结果显示紫杉醇在抑制绒癌细胞JEG-3增殖及促凋亡方面均有显著的作用。

5-杂氮脱氧胞苷对JEG-3细胞及印迹基因H19效应的初步研究

目的:研究甲基化酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,ADC)对人绒毛膜上皮癌细胞株JEG-3细胞的生物学作用,观察JEG-3细胞H19表达变化与滋养细胞增殖、分化和侵袭等行为的相关性,从表观遗传学角度探讨滋养细胞侵袭行为的调控。方法:应用MTT法检测不同浓度5-杂氮脱氧胞苷在不同时相下对JEG-3细胞增殖的影响。体外小室迁移实验观察5-杂氮脱氧胞苷对JEG-3细胞迁移的影响。荧光定量RT-PCR检测5-杂氮脱氧胞苷作用下JEG-3细胞H19mRNA表达的变化。结果:5-杂氮脱氧胞苷对JEG-3细胞增殖起抑制作用,在一定范围内与时间和剂量呈正相关。经100μmol/L5-杂氮脱氧胞苷作用24h后的JEG-3细胞迁移能力明显受限,迁移细胞数较对照组差异显著(P<0.01)。经5-杂氮脱氧胞苷作用后JEG-3细胞中H19mRNA表达增高,在一定范围内与时间和剂量呈正相关。结论:甲基化酶抑制剂5-杂氮脱氧胞苷可致H19mRNA过量表达,并进一步抑制滋养细胞的增殖和迁移能力。H19印迹基因表达上调与滋养细胞增殖抑制和迁移能力降低有关。

基质金属蛋白酶-28在人细胞滋养层细胞与绒毛膜癌细胞系JEG-3细胞中的表达

细胞滋养层细胞和肿瘤细胞的侵入行为具有惊人的相似性，其中基质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）是滋养层细胞和肿瘤细胞侵入的非常重要的介导因素．近来，ＭＭＰｓ家族的一个新成员── ＭＭＰ－２８被克隆并确定下来，采用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、酶谱分析和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ等方法，检测了妊娠早期细胞滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系ＪＥＧ－３细胞中ＭＭＰ－２８的基因表达和蛋白分泌情况．ＲＴ－ＰＣＲ显示，细胞滋养层细胞和ＪＥＧ－３细胞均有ＭＭＰ－２８ ｍＲＮＡ的表达；Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ研究显示，ＪＥＧ－３细胞中ＭＭＰ－２８ ｍＲＮＡ的表达强于细胞滋养层细胞中ＭＭＰ－２８ ｍＲＮＡ的表达，具有时间依赖关系；酶谱分析显示，ＪＥＧ－３细胞中ＭＭＰ－２８蛋白分泌活性高于细胞滋养层细胞中ＭＭＰ－２８蛋白分泌活性，呈时间依赖关系，这与ＭＭＰ－２８的基因表达结果相一致．进一步证明了ＭＭＰ－２８可能在正常妊娠和肿瘤发展等一些与组织重建有关的过程中发挥一定的作用．

葡萄胎病理相关新基因F10与绒癌细胞系JEG-3成瘤性的关系

目的：探讨葡萄胎病理相关新基因F10与绒癌细胞系JEG-3裸鼠皮下成瘤的关系。方法通过细胞转染技术及RNA干扰技术，分别建立和筛选出F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞系JEG-3。取SPF级裸鼠（4~5周龄）30只，随机均分为JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组（n=10），分别接种F10基因过表达的JEG-3细胞、F10基因沉默的JEG-3细胞和未处理的JEG-3细胞株5×107个于颈背部皮下。接种后每3~4 d称量裸鼠质量观察，记录肿瘤发生时间，观察皮下肿瘤的生长情况。绘制在体肿瘤生长曲线，计算各组裸鼠的成瘤率。结果3组的成瘤率均为100%（10/10）。JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组的成瘤时间分别为6.2±0.78、7±2.49、6.3±0.67 d，组间比较无统计学差异（F=0.781，P=0.468）。JEG-3 F10过表达组肿瘤的在体生长速度较JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组增快，差异有统计学意义（P〈0.05），JEG-3 F10未处理组肿瘤的在体生长速度较JEG-3 F10沉默组快（P〈0.05）。细胞接种5周后处死小鼠，取瘤组织称重，JEG-3 F10过表达组、JEG-3 F10沉默组、JEG-3未处理组肿瘤重量分别为571.1±221.10 mg、136.2±66.25 mg、354.5±116.23 mg，组间比较存在统计学差异（F=21.199，P=0.000）。结论 F10基因与绒癌细胞系JEG-3的增殖调节有关，可增强JEG-3细胞系在裸鼠体内的致瘤性。

印迹基因H19对人绒毛膜上皮癌细胞JEG-3侵袭能力的影响

目的探讨印迹基因H19对滋养细胞侵袭能力的影响,以期从分子遗传学角度来阐明滋养细胞侵袭行为的调控机制。方法含人全长H19 cDNA重组真核表达质粒pRc/CMV经测序鉴定正确后,转染滋养细胞株JEG-3,观察其H19 mRNA表达和细胞侵袭力的变化。结果质粒转染JEG-3细胞的转染效率>50%,转染目的基因H19后mRNA表达较对照组显著升高;转染目的基因后JEG-3细胞穿膜细胞数明显少于未转染组和空载体转染组。结论H19基因过表达可抑制JEG-3的侵袭能力,为H19调控滋养细胞侵袭行为提供了直接的实验证据。