JIB-04通过抑制组蛋白赖氨酸去甲基化酶4表达来调控MDM2/P53/SLC7A11/GPX4轴诱导肝癌细胞发生铁死亡

JIB-04(Jumonji histone demethylase inihibitor, JIB-04)是一种泛组蛋白赖氨酸去甲基化酶抑制剂,可抑制多种肿瘤发生发展,但其具体机制仍不清楚。本文以肝癌细胞HepG2和Huh7为研究对象,探讨了JIB-04对肝癌细胞的增殖影响,并揭示其可能的分子机制。CCK-8和EDU检测细胞增殖实验显示,JIB-04明显抑制肝癌细胞HepG2和Huh7活力,且具有浓度依赖性,其半数抑制浓度分别为0.7689μmol/L及0.7392μmol/L。流式细胞术检测细胞内ROS水平变化,结果显示,JIB-04可显著激活细胞内ROS的累积。通过谷胱甘肽(glutathione, GSH)检测试剂盒和脂质过氧化物检测试剂盒分别检测细胞内GSH和脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平发现,在2μmol/L JIB-04处理下,HepG2和Huh7细胞内GSH分别下降88.4%和80.7%,而脂质过氧化物分别升高4.75倍和9.25倍。通过qRT-PCR和Western印迹分析发现,JIB-04显著降低铁死亡相关因子GPX4和SLC7A11的mRNA水平和蛋白质水平,同时铁死亡相关通路蛋白质MDM2明显下调,P53蛋白水平明显上调。机制研究显示,JIB-04可以使赖氨酸特异性去甲基化酶KDM4C的蛋白质水平下调约58%和51%。通过ChIP检测发现,在JIB-04处理肝癌细胞后MDM2基因启动子区域H3K9me3分别提高了2.19倍和2.14倍,同时qRT-PCR证明,JIB-04处理肝癌细胞后MDM2 mRNA水平显著下调。综上所述,本研究初步揭示了JIB-04可下调特异性去甲基化酶KDM4C的表达,进而影响MDM2基因启动子区域H3K9me3甲基化水平抑制MDM2基因表达,减少MDM2蛋白与P53蛋白结合,P53蛋白水平表达上调,同时,铁死亡相关蛋白质SLC7A11和GPX4的表达下调,导致细胞内GSH耗竭、ROS与脂质过氧化物积累,最终导致细胞发生铁死亡。

JIB-04通过调控细胞周期蛋白抑制结肠癌细胞增殖

已有报道显示,组蛋白去甲基化酶抑制剂JIB-04(Jumonji histone demethylase inihibitor,JIB-04)抑制肿瘤的发生发展,但其具体作用机制仍不清楚。本研究以结肠癌细胞HCT116和HT29为对象,探讨组蛋白去甲基化酶抑制剂JIB-04对结肠癌细胞增殖的影响,并阐述其作用机制。MTT和平板克隆形成实验显示,JIB-04以浓度和时间依赖的方式降低HCT116和HT29细胞的增殖能力,半数抑制浓度分别为661.7 nmol/L及226.1 nmol/L,细胞克隆数也明显减少。qRT-PCR和Western印迹结果证明,与未经JIB-04处理的HCT116和HT29细胞比较,细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、细胞周期蛋白E1(cyclinE1)的mRNA水平和CDK4、CDK6及细胞周期蛋白D1的蛋白质水平有不同程度的降低,同时CDK抑制剂p21的蛋白质水平分别上调约1.99倍和2.37倍。检测凋亡相关因子发现,在HCT116和HT29细胞中,p53、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9、Bax、JNK及PUMA的mRNA及蛋白质水平均降低。机制研究显示,JIB-04使组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)的mRNA水平分别下调约56.8%和75.5%,其蛋白质水平下调约27.12%和15.32%。本研究结果表明,JIB-04可改变组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶LSD1的活性,调控细胞周期蛋白及相关因子在mRNA和蛋白质水平的表达,同时诱导凋亡蛋白质发生改变,从而抑制结肠癌细胞增殖和凋亡。

JIB-04通过调节M1型巨噬细胞极化抑制主动脉夹层发生

目的分析组蛋白去甲基酶抑制剂JIB-04对于小鼠骨髓来源巨噬细胞M1极化的影响,探究其与主动脉夹层发生之间的关系。方法提取小鼠骨髓来源巨噬细胞,诱导巨噬细胞M1分化,给予JIB-04药物干预,并通过流式细胞术检测M1型细胞极化率,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)实验检测炎性标志物的RNA表达水平,蛋白质免疫印迹实验检测M1型巨噬细胞标志物的蛋白表达水平,两组间差异比较采用独立样本t检验。结果流式细胞实验显示JIB-04干预组的M1巨噬细胞阳性群比例为(21.90±0.65)%,脂多糖(LPS)刺激组为(35.81±0.49)%,药物干预组相较于LPS刺激组的阳性群比例差异有统计学意义(t=29.36,P<0.01);PCR实验结果显示LPS刺激组的M1型巨噬细胞的炎性标志物一氧化氮合酶(iNOS)相对RNA表达水平为170.60±5.92,药物干预组为38.21±3.41,JIB-04药物干预组的M1型巨噬细胞的炎性标志物低于LPS刺激组,差异有统计学意义(t=38.54,P<0.01),且其余炎性标志物结果同iNOS一致;蛋白免疫印迹实验结果显示LPS刺激组的iNOS的蛋白表达含量为3.51±0.94,药物干预组的iNOS表达含量为1.18±0.17,JIB-04药物干预组的iNOS蛋白表达含量低于LPS刺激组且差异有统计学意义(t=4.84,P<0.05)。结论JIB-04可以通过抑制巨噬细胞M1极化进而调控主动脉夹层的发生。

JIB-04对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的观察JIB-04对肝癌细胞增殖、凋亡的影响，探讨其影响发生的机制。方法用不同浓度的组蛋白去甲基化酶抑制剂JIB-04（0、4、8、16μmol／L）分别处理肝癌细胞HepG2、QGY7703、Huh7、MHCC-97H、MHCC-97L及正常肝细胞L02，采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖变化；流式胞仪检测细胞肝癌细胞HepG2、Huh7及MHCC-97H细胞周期分布及凋亡；选取肝癌细胞HepG2及Huh7行蛋白质印迹法检测凋亡蛋白表达。结果JIB-04对正常肝细胞L02抑制作用不明显，经最高浓度为16μmol／L培养48h后．抑制率仅为6％，而不同浓度JIB-04对各肝癌细胞分别有不同程度的抑制作用，其中对肝癌细胞Huh7及QGY7703抑制作用最明显，其半数抑制浓度（IC50）分别为3、3．5μmol／L，且JIB-04对各肝癌细胞抑制作用呈现时间及浓度依赖性；在流式细胞仪检测中，各肝癌细胞S、M期比例明显减少，而G，期比例明显升高且呈药物浓度依赖性；同时随着JIB-04浓度的增加，肝癌细胞HepG2、Huh7及MHCC-97H凋亡率明显提高，经最高浓度8μmol／L作用48h后其凋亡率分别为（27．84±0．42）％、（25．31±0．93）％、（46．86±0．63）％，且不同浓度组与对照组两两比较其凋亡率差异有统计学意义；在凋亡蛋白检测中，肝癌细胞凋亡蛋白B细胞淋巴瘤／白血病-2相关X蛋白（bax）均上调及B细胞淋巴瘤／白血病-2（bcl-2）均下调，两者肝癌细胞中凋亡蛋白p53均明显上调。结论JIB-04对正常肝细胞抑制作用不明显，但对不同肝癌细胞有不同程度的抑制作用；JIBJD4通过干扰细胞周期分布及诱导凋亡来抑制肝癌细胞增殖；JIB-04有可能通过线粒体凋亡途径来诱导肝癌细胞凋亡。

JIB-04对肝癌细胞株Huh7周期及凋亡的影响及其机制

目的观察JIB-04对肝癌细胞Huh7周期、凋亡的影响。方法用浓度为(0、4、8、16μmol/L)的JIB-04分别处理正常肝细胞L02及肝癌细胞Huh7均由广东医科大学附属医院临床技能中心肝胆实验室提供,用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖变化;用流式细胞仪检测Huh7细胞周期分布及凋亡;蛋白质印迹法(Western blot)检测肝癌细胞Huh7凋亡蛋白表达。采用单因素方差分析或两样本均数比较。结果JIB-04对正常肝细胞L02抑制作用轻微,经JIB-04培养48 h(8μmol/L)后,抑制率仅为5.6%,而不同浓度JIB-04对肝癌细胞Huh7有不同程度的抑制作用,且其抑制作用呈现时间及浓度依赖性,半数抑制浓度(IC50)为3.5μmol/L;在周期检测结果中,肝癌细胞Huh7分期中S、M期比例明显减少,相反G1比例明显升高且呈药物浓度依赖性;Western blot中随着JIB-04浓度的增加,肝癌细胞Huh7凋亡率明显升高,在最高浓度8μmol/L培养48 h后其凋亡率达(28.38±0.73)%,且不同浓度组与对照组两两比较其凋亡率差异有统计学意义(t=2.767,P<0.05);在肝癌细胞凋Huh7亡蛋白检测中,凋亡蛋白p53、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)明显上调,相反B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)下调。结论JIB-04对正常肝细胞无明显抑制作用,可抑制肝癌细胞Huh7增殖,有干扰其周期分布及促进凋亡作用。

苯基吡啶酮衍生物影响猪δ冠状病毒复制的作用分析

本研究旨在探讨苯基吡啶酮衍生物JIB-04对猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)的抗病毒作用,并初步研究可能的作用机制。首先应用CCK-8方法检测不同浓度JIB-04作用后的细胞活力,并计算半数毒性浓度(CC)和半数有效浓度(EC)。应用TCID方法检测JIB-04预处理和共处理对PDCoV复制的影响,检测JIB-04处理对PDCoV吸附或入侵细胞的影响。最后,应用qRT-PCR、TCID和Western blot方法检测JIB-04处理对不同时间点病毒复制的影响。结果表明,JIB-04在所有受试浓度下均不影响LLC-PK细胞的活力,CC>640μmol·L,EC=0.216μmol·L,SI指数>2 963。与未处理的病毒感染组相比,JIB-04处理极显著降低了PDCoV的滴度(P<0.001),但对PDCoV吸附和入侵过程没有影响。感染6 h后,与未处理的病毒感染组相比,JIB-04处理组PDCoV滴度极显著下降(P<0.01);感染12和24 h后,PDCoV滴度、基因组拷贝数、N蛋白表达水平均极显著下降(P<0.01)。JIB-04的细胞毒性较低,药物选择性指数较高,在体外能抵抗PDCoV感染,可以作为潜在的抗病毒药物。在PDCoV感染过程中,JIB-04能够抑制病毒核酸和蛋白质的合成,抑制病毒的复制。