广州地区无偿献血者人群中Jk(a-b-)表型筛选及分子遗传学研究

目的了解广州地区无偿献血者人群中,Kidd血型系统中Jk(a-b-)稀有血型个体的分布频率及分子遗传背景。方法用2 mol/L尿素溶解法,对50 000名广州血液中心无偿献血者中的Jk(a-b-)血型个体进行筛选。用传统的血型血清学方法对筛选到的Jk(a-b-)表型进行确证。随后从静脉血中提取DNA,PCR方法扩增Kidd血型系统编码基因Jk的所有编码外显子,并直接进行测序分析。结果在50 000名无偿献血者中共筛选到10名Jk(a-b-)血型个体,在广州地区无偿献血者人群中其分布频率约为0.02%。在对其中8名先证者基因分型中,共发现了2种基因型,纯合IVS5-1G>A(n=6),杂合IVS5-1G>A/杂合896G>A(299Gly>Glu)(n=2)。结论广州地区无偿献血者人群中,Jk(a-b-)的分布频率高于已报道的北方人群。高频率分布于太平洋波利尼西亚群岛的变异IVS5-1G>A,也是本人群中最常见的基因变异。

深圳地区儿童Kidd血型Jk(a-b-)表型筛选及分子机理研究

目的调查深圳地区人群中Jk(a-b-)表型检出率;探讨深圳地区Jk(a-b-)表型产生的分子机理。方法用尿素溶血实验筛选出Jk(a-b-)表型,采用微柱凝胶法进行Jk(a-b-)表型血清学确认试验,并对Jk(a-b-)表型标本进行DNA提取扩增及纯化测序。结果从20 453儿童标本中筛选出4例Jk(a-b-)表型,检出率为4∶20 453,分布频率为0.019 6。在对其中4名先证者基因分型中,共发现了2种基因型,纯合IVS5-1G>A,杂合IVS5-1G>A合并杂合896G>A。结论深圳地区人群中Jk(a-b-)表型分布频率明显高于国内其它地区,检测到的基因型IVS5-1G>A、杂合IVS5-1G>A合并杂合896G>A是中国人群中最常见的基因变异。

Jk^a抗原弱表达与JK基因第4外显子130A的相关性分析

目的研究分析在中国人群中发现的Jka抗原弱表达（Jka＋w）与JK基因第4外显子130A的相关性。方法共有3800例中国深圳地区汉族献血者的全血标本,经尿素溶解试验筛检并采用常规血型学方法鉴定出Jk（a＋w b-）表现型3例,同时选取100例非相关献血者作为对照组。基因组DNA通过聚合酶链反应扩增JK基因第4—11外显子及部分内含子片段,并对PCR产物进行直接测序比对分析。结果 1）3例Jk（a＋wb-）表型中,2例JK基因第4外显子nt130位点为G/G纯合子,且携带JKB/JKB等位基因;另1例为nt130G/A杂合子,携带JKA/JKB等位基因。2）对照组100例Kidd血型表型分别是,24例Jk（a＋b-）型,43例Jk（a＋b＋）型,33例Jk（a-b＋）型。在24例Jk（a＋b-）表型中,1例nt130G/G纯合子,6例nt130G/A,17例nt130A/A;43例Jk（a＋b＋）表型中,为7例nt130G/G,36例nt130G/A;33例Jk（a-b＋）中均为nt130G/G纯合子基因型。3）在这103例标本中JK基因第8内含子5＇端84位A突变为T,且均为84T/T纯合子。结论 130A突变位点在中国人群中较为常见,但未能证明是引起Jka抗原弱表达的原因。

福建地区稀有血型JK(a-b-)表型筛选及分子遗传学分析

目的了解福建地区无偿献血者Kidd血型系统中JK(a-b-)表型的分布频率并分析其遗传学特征。方法用尿素溶解试验筛查福建地区180 626例无偿献血者JK(a-b-)表型;用经典血清学方法确证其表型;对JK基因的启动子、11个外显子及其侧翼区域(50~150 bp)扩增后测序并分析序列信息;用SNa Pshot技术分析福建地区200例献血者JK基因的单核苷酸多态性(SNP)。结果 180 626例无偿献血者中检出15例JK(a-b-)表型个体。分析15例JK(a-b-)表型个体JK基因,检测出的4种隐性基因分别为JK*B(IVS5-1G>A)、JK*B(896G>A)、JK*A(130G>A,220A>G)和JK*B(130G>A,956C>T),这4种隐性基因分别占检出无效基因的66.67%、23.33%、6.67%和3.33%。分析上述200例献血者JK基因SNP发现,JK*B(IVS5-1G>A)为0.75%,JK基因的G130A是一种常见的多态性,未检测到A220G、C222T、C956T、G896A变异。结论福建地区无偿献血人群中JK(a-b-)表型频率估计约为0.008%,JK*B(IVS5-1G>A)和JK*B(896G>A)是该地区JK(a-b-)表型的主要流行基因,发现1个新的引起JK(a-b-)表型的JK-null基因,即SLC14A1 130A,220G。

Kidd血型系统Jk基因非编码区3个新突变位点的多态性

目的研究Kidd血型系统Jk基因非编码区3个新突变位点的多态性。方法选取深圳地区和惠州地区发现的7例Jk(a-b-)表型血液标本以及115例汉族健康无偿献血者血液标本,经尿素溶解试验及常规血型血清学方法鉴定Kidd表现型,并对于Jk基因启动子,第1~11外显子及部分内含子片段进行直接测序比对分析。结果(1)检出两种Jk隐性基因,Exon 9 c.896G>A和IVS5-1g>a;同时发现3个新的突变位点Intron 2-51 c>t、Exon 3 42 c>a、Intron 3 72 c>t。(2)7例Jk(a-b-)中,5例携带IVS5-1 a/a,2例携带Exon 9 c.896 A/A隐性基因。并且7例标本均携带Intron 2-51 t/t和Exon 3 42 a/a纯合子等位基因,而对照组115例标本中只有29例携带。7例Jk(a-b-)样本均携带JkB基因。(3)7例Jk(a-b-)和对照组115例样本Jk基因均表现为Intron 3 72 t/t纯合子突变。结论IVS5-1 g>a和Exon 9 c.896G>A是中国人群中常见的Jk隐性基因。另外,Jk基因非编码区的2个新突变位点Intron 2-51 t/t、Exon 3 42 a/a基因型可能与Jk隐性基因相关。

Jk(a-b-)表型和基因多态性分析方法的建立及其应用

目的建立筛检Jk(a-b-)表型及其基因分型的方法,探讨Jk(a-b-)形成的分子机制。方法采用红细胞在2mol/L尿素中溶血试验筛选20000名无偿献血者的Jk(a-b-)表型;以IgM型单克隆抗-Jka和-Jkb确认Jk(a-b-);PCR-SSP对Kidd血型做基因分型;PCR扩增JK基因4-11外显子及侧翼内含子,并对扩增产物进行测序。结果在2mol/L尿素溶血试验中,除1例红细胞未发生溶血,初步认定为Jk(a-b-)型外,其他19999例标本均发生溶血。该例不溶血的Jk(a-b-)型与单克隆抗-Jka和-Jkb不发生凝集反应,该Jk(a-b-)表型个体的JK基因在第5内含子3'端拼接接受位点g突变为a,携带纯合子的IVS5-1g>a基因突变,第7外显子499A>G杂合,588A>G突变。结论尿素溶血初筛、单克隆抗体确认、基因分型和测序方法可以用于Kidd系统Jk(a-b-)血型的表型和分子机制研究。

临床JK棒状杆菌抗生素敏感试验及耐药基因的监测

目的揭示临床分离的JK棒状杆菌耐药现状,并做其耐药基因的分析。方法常规鉴定并采用API Coryne鉴定临床标本中分离的棒状杆菌,分离的JK棒状杆菌采用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度,根据美国NCCLS判断"敏感"、"耐药"和"中介"。采用PCR方法进行基因扩增。结果共分离出6株JK棒状杆菌,对临床常用的抗生素:青霉素、头孢唑啉、头孢美唑、头孢吡肟、亚胺培南、阿米卡星、克林霉素、环丙沙星、红霉素、米诺环素均表现高的最低抑菌浓度(MICs)值,对糖肽类的替考拉宁、万古霉素表现低的MICs值。采用自动测序仪对临床分离的多耐菌株进行基因测序(applied biosystems califo,USA)。结论临床分离的JK棒状杆菌呈现出多耐现象并存在耐药基因。

番禺地区无偿献血人群中Jk(a-b-)表型的筛选与研究

目的研究番禺地区献血人群中Jk(a-b-)表型的分布特点。方法用2mol/L尿素攻膜试验(96孔微量板法)筛选出阴性(不溶血)样本,然后作血清学表型鉴定,对Jk(a-b-)表型进行基因分型及基因组DNA编码区外显子4-11及其侧翼区的分段扩增和测序。结果从本站2004年6月-2006年8月献血的50034名汉族人中筛选出10例Jk(a-b-)表型,频率为0.02%;发现3种突变序列:1)Intron5:3'剪切位点AG>AA,Exon7:nt588A>G、AA196CCA(Pro)>CCG(Pro),推测基因型为JKb(△6)/JKb(△6);2)Exon5:nt222C>A、AA74AAC(Asn)>AAA(Lys),Exon7:nt536C>G、AA179CCT(Pro)>CGT(Arg),Exon7:nt588A>G、AA196CCA(Pro)>CCG(Pro),推测基因型为JKb(222A)/JKb(536G);3)Intron5:3'剪切位点AG>AA,Exon7:nt499A>G,AA167ATG(Met)>GTG(Val),Exon7:nt588A>G、AA196CCA(Pro)>CCG(Pro),推测基因型为JKb(△6)/JKb(499G)。结论在番禺地区献血人群Jk(a-b-)表型查中发现的Exon7:nt499A>G和Exon7:nt536C>G2种突变为首次报道。

瓦雷兹芽孢杆菌JK-XZ8对樱花根癌病的防效与抑菌物质初探

[目的]樱花根癌病近年对樱花产业的威胁日益严重,生产上亟需有效的防治措施。本研究旨在探讨瓦雷兹芽孢杆菌JK-XZ8的抑菌物质特性,同时测定其对樱花根癌病的田间防治效果。[方法]在平板拮抗测定菌株拮抗能力,通过酸沉淀提取该菌株的抑菌粗提物;利用PCR技术检测该菌是否含有推测的抑菌物质合成相关基因,测定该抑菌粗提物在不同条件下的稳定性;采用根部蘸浆法测定瓦雷兹芽孢杆菌(Bacillus velezensis)JK-XZ8对田间樱花苗木的生防效果。[结果]瓦雷兹芽孢杆菌JK-XZ8对根癌土壤杆菌存在拮抗能力且可产生抑菌物质;经PCR检测该菌株含有脂肽类基因bmyB,ituD,fenD和聚酮类化合物基因PK1、PK2、PK3等抑菌物质合成相关基因。此外粗提得到的抑菌物质,在高温、酸、碱、蛋白酶K、3 h内的紫外线的处理条件下,仍保持较高活性。田间试验表明菌株JK-XZ8对樱花根癌病的防治效果可达50%,优于市场上使用的K84生物菌肥(24%)。[结论]瓦雷兹芽孢杆菌可以产生稳定的抑菌物质拮抗病原菌,是一株可用于樱花根癌病防治的有效生防菌株。

宜昌地区献血者Jk(a-b-)频率与Jka弱表达表型分子遗传机制研究

目的了解宜昌地区献血人群Kidd血型系统Jk(a-b-)稀有血型频率与分子遗传学背景。方法用2 mol/L尿素溶血试验对49 999名宜昌中心血站献血者进行Jk(a-b-)筛选,利用单克隆抗-Jk^(a),抗-Jk^(b)对Jk(a-b-)先证者及家系进行表型确证,并对Kidd血型系统编码SLC14A1基因进行全外显子测序。结果 49 999名献血者共筛选出Jk(a-b-)个体2名,频率为0.004%。SLC14A1基因外显子测序中确认2名先证者皆为Jk^(a)02N.01(c.342-1G>A纯和突变所致),并在家系调查中观察到Jk^(*)01W.01等位基因,11例家系调查样本中共出现Jk^(a)弱表达4例。结论宜昌地区献血人群Jk(a-b-)频率与上海人群0.004%(2/48 400)相似,皆为东南亚地区高频分布的Jk^(a)02N.01等位基因所致,Jk^(a)01W.01等位基因频率值得进行后续流调研究。

广东惠州地区献血者Kidd血型基因频率分布与输血风险评估

目的通过对惠州地区无偿献血者Kidd血型抗原进行检测,了解其在人群中的分布特点及Jk(a-b-)分子遗传背景,对其在临床输血中的风险进行评估。方法采用微板法尿素溶血试验对惠州市中心血站2016年12月—2017年12月的30 475例献血者进行Kidd血型抗原筛查,筛出的Jk(a-b-)型用血清学试管法进行确认,并提取其DNA用PCR方法扩增JK基因第4—11外显子及部分内含子片段,对扩增产物进行直接测序分析。随机抽取献血者标本426例,采用试管法对其Kidd血型抗原进行鉴定,并计算输血不合风险。结果在30 475例献血者中筛选出7例Jk(a-b-)表型,分布频率为0.023%。对其中5名Jk(a-b-)献血者进行基因测序,发现2种基因变异:4名为纯合IVS5-1G>A,1名为纯合896G>A。Jk^(a )和Jk^(b )的基因频率分别为0.434 3和0.565 7。Jk^a不配合输血的风险为0.217 6,Jk^(b )不配合的风险为0.153 0,Jk^(a )和Jk^(b )不配合的风险合计为0.370 6。抗-Jk^(a )随机输血不配合的概率为69.0%,抗-Jk^(b )随机输血不配合的概率为82.2%。结论惠州地区Kidd血型基因频率分布符合Hardy-weinberg群体遗传平衡法则;IVS5-1G>A基因变异是本地区人群中最常见的变异。建立Jk(a-b-)稀有表型资料库,储备一定数量的该类血液制品,对于该类表型的稀有血型患者的安全输血具有重要意义。

Kidd血型基因多态性位点连锁突变及作为快速分型分子标记的探讨

目的研究中国人群Jk基因单核苷酸多态性与Jk^a、Jk^b抗原表型的关系,寻找其规律性,作为Kidd血型快速分子分型的标记。方法选取183份血液标本,其中174来自于中国深圳地区汉族健康无偿献血者,另外还包括3例Jk（a^w＋b-）以及6例Jk（a-b-）标本。首先,采用尿素溶解试验与血清学方法鉴定Kidd表现型。然后,扩增Jk基因第4—11外显子及部分内含子片段,进行DNA测序,比对测序结果寻找SNPs,并分析其与表型的关联。结果1）经DNA序列分析与表型比对,发现在183例标本中,无论何种Kidd表型,intron 7—68与exon 9 838两个位点的单核苷酸置换始终一致,表现出明显的连锁突变特征。2）在这183例标本中同时发现,Kidd血型的Jk^a和Jk^b抗原多态性与这两个位点的多态性之间也具有明显规律：80例Jk（a＋b＋）标本全部检测出Jk基因intron 7（-68C/T）与exon 9（838G/A）基因型; 40例Jk（a＋b-）则是intron 7 （-68C/C）与exon 9 （838G/G）纯合突变;相反,所有的Jk（a^（w/-））标本,包括54例Jk（a-b＋）、3例Jk（a^w＋b-）与6例Jk（a-b-）,则表现为intron 7 （-68T/T）与exon 9 （838A/A）纯合突变。结论我们使用DNA测序技术对Jk基因的分子背景进行研究,发现了intron 7—68与exon 9 838两个位点单核苷酸多态性的连锁突变特征,及其与Kidd表型的一致性规律。我们提出了1种血型分型的新思路：通过对大量筛查,找出与表型呈现出明确规律性的SNPs作为分子标记,通过对其进行单一性检测从而达到对血型快速分型的目的。

Kidd血型基因启动子区域单核苷酸多态性及其等位基因频率与分布特征研究

目的:分析中国汉族人群Jk基因启动子区单核苷酸多态性(SNP)及其等位基因频率与组合分布特征。方法:选取127例血液标本,包括8例Jk(a-b-)标本与119例随机选择的中国深圳地区汉族健康无偿献血者血样,利用血清学方法与尿素溶血试验鉴定Kidd血型表型,并对Jk基因启动子与外显子1-11及其侧翼的区域扩增后测序,分析序列信息。结果:8例Jk(a-b-)标本全部携带JkB/JkB等位基因,并且分属于2种中国汉族人群常见的Jknull基因型:6例为IVS5-1g>a,2例为896G>A。另外,对于Jk(a-b-)标本启动子区域的序列分析发现3个SNP:-110(rs900974)、-160(rs1484877)、-258(rs1484878)。统计不同Kidd表型中3个SNP的基因型频率显示符合Hardy-Weinberg平衡。这表明,本研究所选择标本对中国汉族人群具有代表性。结论:Kidd血型的Jk基因在启动子区域具有多态性。本研究对其启动子区域3个SNP的等位基因频率的统计分析揭示了其在不同Kidd表型中的组合分布特征,为进一步进行群体遗传学研究奠定基础。

济宁地区无偿献血人群Jk(a-b-)表型的频率及分子遗传学分析

目的筛查济宁地区无偿献血人群的Jk(a-b-)表型,并分析其分子遗传学基础,完善本地的稀有血型库。方法选取济宁市中心血站2019年7月至2021年1月的无偿献血人群为研究对象。用2 mol/L尿素法筛查Jk(a-b-)表型,用经典血清学方法确认结果,并对SLC14A1基因第3~10外显子及其侧翼区进行Sanger测序分析。结果在95500份无偿献血者的样本中,尿素溶血实验共3例未发生溶血现象,经血清学方法复核为Jk(a-b-)表型且均无抗-Jk3抗体。济宁地区Jk(a-b-)表型的分布频率为0.0031%(3/95500)。经基因测序和单体型分析,确认3例样本的基因型分别为JK*02N.01/JK*02N.01、JK*02N.01/JK-02-230A以及JK*02N.20/JK-02-230A。结论SLC14A1基因第4内含子c.342-1G>A剪接变异、第4外显子c.230G>A以及第6外显子c.647648delAC为本地区人群Jk(a-b-)表型相关的变异位点,与国内其他地区有所不同,其中c.230G>A变异既往未见报道。

产前非创伤性检测胎儿kidd血型基因型方法的建立及其应用

目的:利用孕妇血浆中游离胎儿DNA建立产前非创伤性诊断Kidd血型基因型的实时荧光PCR技术(RQ-PCR)。方法:采用QIAamp试剂盒抽提孕妇血浆DNA,利用短串联重复序列(STR)确认提取物存在胎儿DNA,利用RQ-PCR检测胎儿Kidd基因型。采用血清学方法检测婴儿脐带血Kidd表型,回顾性评价基因分型方法的准确性。结果:在182例孕妇中筛选出96例纯合子Kidd表型,进一步通过鉴定其婴儿脐带血Kidd表型,从中筛选得到46例标本孕妇纯合子表型而婴儿脐带血JK(a+b+)表型。在这46例孕妇血浆DNA标本中能检出父源性等位基因的标本为38例,孕妇表型分别为6例JK(a+b-)和32例JK(a-b+)。38例孕妇血浆DNA标本用RQ-PCR法均检测到了孕妇所不具备的JK*B或JK*A父源性等位基因,其结果与婴儿脐带血Kidd表型相吻合。结论:本实验建立的RQ-PCR非创伤性产前诊断胎儿Kidd血型基因型是可行的,当孕妇为纯合子时可通过产前非创伤性基因分型辅助诊断和预防新生儿溶血病。

PCR-高分辨熔解曲线法在Kidd血型基因分型中的应用

目的探讨PCR-高分辨熔解曲线(HRM)法在Kidd血型基因分型中的应用。方法采用简单随机抽样法,选择2019年10月至11月,于深圳市血液中心参加无偿献血的256例献血者为研究对象。本组献血者年龄为18~60岁;男性献血者为142例,女性为114例。采用血型血清学试验方法对本组献血者全血标本的红细胞抗原表型进行检测。采用PCR-SSP和PCR-HRM法对本组献血者的DNA标本进行Kidd血型基因分型。对于基因分型与血型血清学检测结果不一致的标本,则通过JK基因第9外显子直接测序法进行确认。本研究遵循的程序符合2013年修订版《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求,并且于献血前与所有献血者签署《献血者知情同意书》。结果①本组256例无偿献血者全血标本的血型血清学检测结果显示,Jk(a-b+)、Jk(a+b+)和Jk(a+b-)表型献血者分别为86、109和61例。②本组256例献血者基因组DNA标本的PCR-SSP和PCR-HRM法的Kidd血型基因分型结果一致,JKB/JKB、JKA/JKB和JKA/JKA基因型献血者分别为82、115和59例。③22例(8.6%,22/256)献血者的血型血清学表型与基因分型结果不一致。其基因组DNA标本经JK基因第9外显子直接测序结果显示,JK基因第9外显子存在c.838 G>A突变,与JKA/JKB基因分型结果相符。结论本研究建立的PCR-HRM法可准确进行Kidd血型基因分型,该方法可以有效地辅助Kidd血型精准鉴定。在进行Kidd血型鉴定的实际工作中,可联合血型血清学和PCR-HRM法,以提高Kidd血型鉴定准确度。