Cloning and Sequence Analysis of the Full-Length Genome of Japanese encephalitis virus Strain SXBJ07 Isolated from Swine

A virus strain, showing cytopathic effect in BHK-21 cell, was isolated from swine brains in Shaanxi Province, China, in 2007. The isolate was confirmed as Japanese encephalitis virus （JEV） by immunofluorescence assay （IFA） and reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR）, and named SXBJ07. The complete nueleotide and deduced amino acid sequences of the JEV strain SXBJ07 were determined. Its single open reading frame has a total of 3 432 amino acid residues. An extensive E gene based phylogenetic analysis was performed, the result showed that SXBJ07 strain belongs to genotype I. Comparison of the SXBJ07 genomic sequence with those of the 24 fully sequenced JEV strains in published databases showed nucleotide homology ranging from 99.0 to 83.7%; amino acid homology ranged from 99.8 to 94.8%. Compared SXBJ07 with SA14-14-2 strain, the current live vaccine strain in China, the homology of amino acid in envelope gene was 97.0%; and there were amino acid substitutions in 13 sites of the active domains of E protein （E1-E411）.

日本脑炎病毒(JEV)内蒙古分离株M73-1E基因的5′端克隆及部分序列分析

根据国外报道的 JEV( Japanese encephalitis virus)基因组全序列 ,针对 JEV E基因 5′端设计合成一对特异引物 ,以日本脑炎病毒内蒙古分离株 M73-1 RNA为模板 ,经 RT-PCR扩增 ,获得 366bp的 JEV E基因 c DNA片段 .将此片段重组于质粒 p UC1 9中 ,并转化大肠杆菌DH5α.经 PCR扩增 ,酶切及序列分析 ,结果表明 JEV M73-1 5′端 1 2 6个核苷酸序列与 JEV日本 Nakayama株和 Ja OAr S982株的同源性分别为 96.8%和 96.8% ,氨基酸序列同源性均为 99.2 % .通过对病毒基因组结构分析从分子水平上进一步证实了 1 973年在呼和浩特市流行的脑炎是由 JEV引起的流乙脑炎 .E基因编码 JEV的囊膜糖蛋白 ,是其重要表面抗原 .JEV M73-1 E基因 5′端克隆和部分序列分析对 JEV的分子生物学研究。

重庆三峡库区2012年乙脑病毒分离株基因序列分析

目的通过分析2012年重庆三峡库区蚊虫中分离乙脑病毒株PrM及E基因序列，揭示毒株的遗传特性。方法对新分离乙脑病毒的PrM及E基因进行PCR扩增，将扩增产物测序。用分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析，并绘制系统进化树。结果新分离的8株乙脑病毒株均为基因I型，与我国其他省市的既往分离株进化关系较近；分离株与减毒活疫苗株SA14—14—2相比较，PrM区核苷酸同源性在85．1％～86．7％之间，氨基酸同源性在95．1％～96．3％之间；E基因区核苷酸同源性在87．6％～87．8％之间，氨基酸同源性在96．9％～97．1％之间。所有新分离株与疫苗株在E基因存在14个氨基酸差异位点。结论2012年8株重庆乙脑分离株为基因I型，在E基因区域与疫苗株相比有部分差异。

乙型脑炎病毒减毒中间株SA_(14)-12-1-7基因组全序列的测定

本研究通过对乙型脑炎活疫苗减毒过程中间株SA14 12 1 7株进行全序列测定和分析 ,进一步了解乙脑活疫苗减毒及其稳定性的分子机制。根据已发表的SA14 14 2株及SA14 株的序列 ,设计 6对重叠引物 ,涵括整个乙脑病毒的基因组 ,通过RT PCR扩增出SA14 12 1 7株的各cDNA片段 ,分别克隆到pGEM T载体 ,转化至TG1受体菌中 ,挑取阳性克隆进行鉴定后测序。结果表明SA14 12 1 7株基因组全序列长 10 976个核苷酸 ,从 96到 10 394为一个长开放读码框 ,编码 3432个氨基酸。与野毒株SA14 和疫苗株SA14 14 2的核苷酸序列和氨基酸序列相比 ,同源性均在 99%以上 ,突变位点分散于各个区域 ,E区有 5个位点与疫苗株一致而与野毒株不同 ,3个位点与野毒株一致而与疫苗株不同 ,推测与其容易产生回复突变、恢复毒力有关。此外 ,NS3、NS5和 3′NTR的几个位点可能与病毒毒力稳定性相关。综上所述 ,乙脑病毒减毒中间株的基因组全序列基本类似于已发表的序列 ,若干突变位点影响病毒的弱毒性及毒力的稳定性。

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒。利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较。preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸)。对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同。认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关。

乙型脑炎病毒减毒SA14-14-2-B3株基因组全序列分析

为进一步了解乙型脑炎病毒(JEV)减毒疫苗株基因组变异和分子遗传特性,本研究根据已发表的JEV基因组序列,设计合成了8对引物,应用RT-PCR对SA14-14-2-B3株基因组进行了克隆和序列测定,获得了该株病毒的全基因组序列(10977nt)并推导出其编码的氨基酸序列(3432aa)。序列分析表明:SA14-14-2-B3株与疫苗株SA14-14-2和SA(A)及野毒株SA14的核苷酸和氨基酸相似性较高,分别为99.8%、99.9%、99.4%和99.7%、99.8%、99.1%,与猪源分离株HEN0701和KV1899的核苷酸与氨基酸相似性较低,分别为88.5%、88.5%和97.6%、96.6%,比较显示在SA14-14-2-B3株基因组第10700nt处有一碱基"G"的插入。以全基因组为基础,对SA14-14-2-B3株进行遗传进化关系分析,结果表明:SA14-14-2-B3株与SA14源病毒株SA14、SA14-14-2、SA(A)、SA(V)及分离株Beijing-1、p3、WHe和HW的遗传关系较近,与XJP613株和HEN0701株的遗传关系较远。以E基因为基础,对SA14-14-2-B3株进行遗传进化关系分析,结果表明SA14-14-2-B3株属于JEV基因Ⅲ型。

乙型脑炎病毒减毒活疫苗生产株SA_(14)-14-2基因组全序列的测定

目的 对乙型脑炎减毒活疫苗SA14 1 4 2生产株进行全序列测定和分析 ,为进一步了解其基因组结构与疫苗减毒机制的关系及研究疫苗生产的遗传学质控标准奠定基础。方法 根据已发表的SA14 1 4 2株及SA14株的序列 ,设计 6对相互重叠片段的引物 ,通过RT PCR扩增出SA14 1 4 2疫苗生产株的cDNA片段 ,分别克隆到pGEM T载体 ,转化至TG1受体菌中 ,挑取阳性克隆进行鉴定后测定全序列。结果 SA14 1 4 2生产株基因组全序列长 1 0 976个核苷酸 ,96到 1 0 3 94为一个长开放读码框 ,编码 3 43 2个氨基酸。与国外测定的SA14和SA14 1 4 2株的核苷酸序列和氨基酸序列相比 ,同源性均在 99%以上 ,突变位点分散于各个区域 ,以往推测的 7个可能与减毒相关的位点均未发生改变。1 2 96～ 1 50 6间有 4个突变位点 ,有可能作为疫苗质控的遗传学标记。结论 乙脑减毒活疫苗生产株的基因组全序列基本类似于已发表的序列 ,若干不同位点产生的原因可能在于病毒株的不同传代。全序列的测定对于研究疫苗株的减毒机理及疫苗的遗传学质控标准具有一定意义。

猪源乙型脑炎病毒HEN0701株全基因组的分子特征

将乙型脑炎病毒HEN0701株基因组RNA分4段进行RT-PCR扩增,并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO载体中,测定全长cDNA序列。以MapDraw软件分析了乙型脑炎病毒HEN0701株的基因组结构,并将病毒基因组分成2个非编码区和10个基因,比较了HEN0701株和11株乙型脑炎病毒在全基因组和各基因的核苷酸及推导氨基酸的同源性。以MEGA5软件绘制HEN0701株和11株病毒C、E、NS3、NS5基因的进化树。结果显示,HEN0701株全基因组为10 965 nt,包含一长10 299 nt的开放阅读框。在核苷酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株的全基因组和各基因的同源性均高,而与GⅢ分离株则较低;而在氨基酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株在多聚蛋白和各病毒蛋白的同源性和HEN0701株与GⅢ分离株的相近。进化分析显示,不同基因进化树的拓扑结构相近,12株病毒的C、E、NS3、NS5基因进化方向相同,GⅠ分离株和GⅢ分离株间C基因进化距离最近。

低神经外毒力乙脑病毒M47株的分子生物学特征

目的探究低神经毒力乙脑病毒M47株的分子生物学特征,以期找出其低毒力的分子基础。方法采用RTPCR法扩增M47株病毒全长基因片段,测定其序列,并与GenBank中19株代表性乙脑病毒株全基因序列进行核苷酸和氨基酸比对分析。结果 M47株属于基因Ⅲ型,与GenBank中19株代表性乙脑病毒株核苷酸序列同源性为79.4%-99.6%,氨基酸序列同源性为91.3%-99.6%;氨基酸序列比对发现,该毒株存在一个独特的氨基酸位点改变E-29（S-R）。结论 M47株独特的氨基酸位点改变E-29（S-R）可能是导致其低神经外毒力的原因。