利用siRNA靶向沉默Jeko-1细胞survivin mRNA基因的实验研究

本研究旨在探讨Survivin基因在淋巴瘤细胞中的生物学作用,为将来以Survivin为靶点治疗套细胞淋巴瘤提供实验室证据。体外化学合成针对survivin mRNA基因的siRNA片段,通过DMRIE-C转染Jeko-1细胞,以无关siRNA、未转染的细胞为对照,采用RT-PCR和Western blot方法检测siRNA的抑制效果,利用流式细胞术检测细胞的凋亡率,用CCK-8法检测转染24、48、72 h对细胞增殖的影响。结果表明,与未转染的空白组相比,siRNA转染Jeko-1细胞后24、48、72 h survivin mRNA的相对表达量分别为0.49±0.03、0.38±0.02和0.17±0.02;细胞增殖抑制率分别为(31.2±2.1)%、(43.3±3.4)%和(52.6±2.5)%;细胞凋亡率分别为(6.3±0.5)%、(13.5±1.1)%和(23.6±1.6)%;survivin蛋白表达水平逐步减低。结论:靶向survivin的siRNA能在体外特异性下调目的基因survivin mRNA和蛋白的表达,表现出抑制Jeko-1细胞增殖和促使其凋亡的生物学效应,survivin基因有望成为淋巴瘤治疗的一个药物靶点。

shRNA干扰AKT基因对Jeko-1细胞增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响

目的:探讨RNA干扰沉默AKT基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响。方法:设计针对AKT基因短发夹RNA,将其连入pGPU6/GFP/Neo质粒中,构建AKT shRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞,应用RQ-PCR及Western blot鉴定其干扰效果,MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白信号及通路相关蛋白p-AKT、Notch1、HES1的变化。结果:AKT shRNA转染Jeko-1细胞后,AKT的mRNA和蛋白表达均明显下降,有统计学意义(P<0.05);转染组细胞增殖率明显低于Neg-shRNA组和空白对照组(P<0.05),AKT shRNA传染48 h后,凋亡率为(37.72±4.39)%,而NegshRNA组和空白对照组分别为(2.62±1.53)%、(1.57±0.42)%,差异有统计学意义(P<0.01);凋亡相关蛋白BCL-2表达下降,而BAX、caspase-3、caspase-9表达上升;PI3K/AKT信号通路相关蛋白p-AKT磷酸化水平下降、Notch1信号通路相关蛋白Notch1、HES1表达下调。结论:干扰沉默AKT基因可抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是特异性抑制PI3K/AKT信号通路也能下调Notch1信号通路的活性。

盐酸青藤碱对Jeko-1细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制研究

目的:探讨盐酸青藤碱对人套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株增殖、凋亡及AKT信号通路的影响。方法:应用四甲基偶氮唑盐方法(MTT)绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,Western blot检测细胞周期蛋白CyclinD1、凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、Caspase-3及Akt信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的变化。结果:盐酸青藤碱能明显抑制Jeko-1细胞株的增殖,Jeko-1细胞经终浓度为0、1、2和4 mmol/L盐酸青藤碱作用24 h后,凋亡率分别为(2.21±1.05)%、(11.29±2.42)%、(18.79±2.84)%和(31.05±3.52)%,其差异有统计学意义(P<0.01);Western blot检测发现,细胞周期蛋白CyclinD1、凋亡相关蛋白BCL-2表达下降,而BAX、Caspase-3蛋白表达上调,Akt信号通路相关蛋白中Akt表达无变化,而p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K蛋白磷酸化水平降低。结论:盐酸青藤碱可明显抑制Jeko-1细胞增殖,其机制有可能通过下调Akt信号通路中的p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K磷酸化水平,从而抑制Akt信号通路,促进细胞凋亡。

Jeko-1细胞株中边群细胞的免疫表型、干细胞基因和集落形成能力的生物学特点

目的:初步探讨套细胞淋巴瘤中边群细胞的体外细胞生物学特性。方法:利用流式细胞术分选结合连续培养富集JeKo-1细胞中的边群细胞,并对其进行CD19、IgM免疫表型分析;用qRT-PCR进行基因验证及集落形成实验了解边群细胞及非边群细胞基因表达及体外自我更新能力的差异。结果:通过连续分选结合培养的方法可以富集JeKo-1细胞株中的边群细胞,且边群细胞中包含比例不同的4群细胞:CD19^-/IgM^-为(2.79±0.82)%,CD19^-/IgM^+为(70.99±13.61)%,CD19^+/IgM^-为(0.55±0.25)%,CD19^+/IgM^+为(25.67±14)%。Bmi-1、CD133、C-MYC、Nanog基因在边群细胞高表达,而在非边群细胞中低表达(P<0.05)。边群细胞具有更强的体外集落形成能力(P<0.05)。结论:套细胞淋巴瘤JeKo-1细胞株含有边群细胞,该群细胞可通过连续分选及培养进行富集后用于研究;JeKo-1中的边群细胞具有更强的干性基因及体外自我更新能力,并含有4种免疫表型不同的细胞群体:CD19^-/IgM^-、CD19^-/IgM^+、CD19^+/IgM^-、CD19^+/IgM^+。

咪达唑仑对套细胞淋巴瘤细胞系JeKo-1的作用及机制研究

本研究探讨咪达唑仑(midazolam)对套细胞淋巴瘤细胞系JeKo-1的作用及相关机制。采用CCK8法观察咪达唑仑对JeKo-1细胞增殖的影响;流式细胞术分析咪达唑仑对JeKo-1细胞凋亡的影响;Western blot法检测咪达唑仑对JeKo-1细胞BCL-2、细胞色素C(Cyto-C)、pro-caspase-9、pro-caspase-8、pro-caspase-3蛋白表达的影响。结果表明,咪达唑仑能明显抑制JeKo-1细胞增殖,48 h的半数抑制浓度(IC50)约为40μmol/L;不同浓度咪达唑仑处理48 h后JeKo-1细胞出现凋亡,呈现剂量依赖性;同时,JeKo-1细胞内BCL-2、pro-caspase-9、pro-caspase-3蛋白表达呈剂量依赖性降低,Cyto-C蛋白表达呈相应增加,而pro-caspase-8蛋白表达则未发生变化。结论:咪达唑仑可能通过下调JeKo-1细胞BCL-2的表达,触发线粒体凋亡途径,但不活化死亡受体途径,导致线粒体Cyto-C的释放,并引发caspase-9、caspase-3的活化,启动了caspase级联反应,最终导致了JeKo-1细胞的凋亡。

13-顺式维甲酸联合干扰素Gt2b对套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1细胞作用及其机制的体外研究

目的探讨13-顺式维甲酸/异维甲酸（13cRA）、干扰素α2b（IFN-α2b）单独及联合应用对套细胞淋巴瘤（MCL）细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用及其机制。 方法13cRA、IFN-α2b单独及其联合应用于MCL细胞株Jeko-1细胞，应用CCK-8法检测不同药物处理方案对细胞增殖的影响，Annexin Ⅴ/PI双重染色法检测其对细胞凋亡的影响，流式细胞术（FCM）检测其对细胞周期的影响，Western blot法检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）及凋亡途径相关蛋白caspase-9、Rb的表达。 结果①单用13cRA、IFN-α2b及联合应用均对Jeko-1细胞增殖有抑制和诱导凋亡作用（P值均〈0.05）；13cRA（100 μmol/L）＋ IFN-α2b（10 000 IU/ml）联合组对细胞的增殖抑制率在第1天为（69.37±8.31）%，细胞凋亡率在第5天为（99.87±0.12）%（联合用药协同系数为0.735），均高于阳性对照组的（63.34±4.22）%和（87.80±3.22）%，差异均有统计学意义（P值均〈0.05）；抑制增殖与促凋亡作用均呈药物浓度和时间依赖性，并引起G1期＋G2期细胞比例的明显增加（P〈0.05），S期细胞明显减低（P〈0.05）。②单用13cRA、IFN-α2b及联合应用均能下调Jeko-1细胞Cyclin D1及Rb蛋白的表达水平，促进caspase-9裂解。 结论单用13cRA、IFN-α2b及联合应用均对Jeko-1细胞有抑制增殖和诱导凋亡效应，可降低S期细胞比例，使细胞停滞于G1、G2期，两药联合应用有协同作用；其作用可能与下调Cyclin D1、Rb蛋白的表达水平及激活caspase-9有关。

苯丁酸氮芥抗套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1作用机制的研究

目的:探讨苯丁酸氮芥抗套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1作用机制。方法:应用MTT法检测苯丁酸氮芥对Jeko-1细胞增殖的影响,Hoechst染色及Annexin V-FITC双染检测苯丁酸氮芥对Jeko-1细胞凋亡的影响,Western blot检测苯丁酸氮芥对Jeko-1细胞凋亡相关蛋白BAX,BCL-2,procaspase 3,procaspase 8,procaspase 9表达水平及PI3K/AKT信号通路的激活情况。结果:苯丁酸氮芥0、5、10和20μmol/L作用Jeko-1细胞24、48、72 h后,细胞增殖受到抑制,并呈时间及剂量依赖性(r=0.873,r=0.932)。0,5,10,20μmol/L苯丁酸氮芥作用Jeko-1细胞72 h后,细胞凋亡率显著提高,BAX,procaspase 3,procaspase 8及procaspase 9蛋白表达水平显著上调,BCL-2表达水平显著下调,PI3K蛋白及AKT磷酸化水平显著降低。结论:苯丁酸氮芥能显著诱导套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1凋亡,其作用机制与调节PI3K/AKT信号通路有关。

CD5分子对套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1化疗敏感性的影响及其机制研究

目的 研究CD5分子对套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1的化疗敏感性及其通路的影响。方法 Crispr/cas9法敲除人源套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1（P）CD5基因靶位点，构建CD5阴性Jeko-1（N）细胞。RT-PCR检测Jeko-1（P）与Jeko-1（N）中CD5-E1A与CD5-E1B的表达。MTS法检测柔红霉素、长春新碱对Jeko-1（P）与Jeko-1（N）细胞增殖抑制效应。ELISA法检测Jeko-1（P）与Jeko-1（N）中IL-10表达。Western blot法检测BAY 11-7082处理与未处理的Jeko-1（P）与Jeko-1（N）中核转录因子-κB （NF-κB）信号通路相关p-IKKβ、p-IκB、p-p65蛋白水平。ELISA法检测应用BAY11-7082处理及未处理的Jeko-1（P）与Jeko-1（N）中IL-10的表达情况。结果 Jeko-1（P）细胞表达CD5-E1A、CD5-E1B，Jeko-1（N）细胞不表达CD5-E1A、CD5-E1B，IL-10分泌减少（P〈0.05）。柔红霉素及长春新碱处理24 h和48 h后的Jeko-1（N）细胞与Jeko-1（P）细胞相比，细胞增殖抑制率增加（P〈0.05）。BAY 11-7082处理Jeko-1（P）与Jeko-1（N）细胞相比，p-IKKβ、p-IκB、p-p65（核內和核外）、IL-10表达水平差异无统计学意义（P〉0.05）。与未处理的Jeko-1（P）组相比，BAY11-7082处理的Jeko-1（P）组与Jeko-1（N）组细胞p-IKKβ、p-IκB 、p-p65（核內和核外）、IL-10 表达水平下降，差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 CD5分子通过NF-κB信号通路上调套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株IL-10的分泌以影响其化疗敏感性。

CD5分子调控套细胞淋巴瘤细胞株对柔红霉素化疗敏感性的机制研究

目的探索CD5分子对套细胞淋巴瘤化疗药物敏感性的影响及其分子机制。方法Crispr／cas9法敲除人源套细胞淋巴瘤细胞株Jeko-1（P）的CD5基因，构建Jeko—1（N）（CD5negative）细胞；RT—PCR检测Jeko-1（P）与Jeko-1（N）细胞CD5-E1A和CD5-E1B表达；以不同浓度柔红霉素处理2种细胞，MTS法检测细胞增殖抑制效应；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡；Western blot检测细胞凋亡抑制蛋白B淋巴细胞瘤2蛋白（B—celllymphoma-2，Bcl-2）、人粒细胞白血病1蛋白（myeloidcellleukemia-1，Mcl—1）、B淋巴细胞瘤XL蛋白（B—celllymphoma—xl，Bcl—XL）的表达。结果Jeko-1（N）细胞不表达CD5-E1A、CD5-E1B；柔红霉素处理后，Jeko-1（N）细胞抑制率高于Jeko-1（P）细胞，IC50低于Jeko-1（P）细胞（P〈0．05），G0／G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少（P〈0．05），24h、48h细胞凋亡率较Jeko-1（P）增加，Bcl-2、Mcl蛋白表达量较Jeko-1（P）细胞无明显变化，凋亡抑制蛋白Bcl—XL表达量上调。结论CD5基因敲除的Jeko-1细胞株通过调控淋巴瘤细胞阻滞于G0／G1期，以及上调Bcl—XL蛋白的表达增强对柔红霉素的化疗敏感性。

西达本胺对利妥昔单抗耐药B细胞淋巴瘤增殖的影响及作用机制

目的探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂西达本胺在体外对利妥昔单抗耐药的B细胞淋巴瘤细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法采用不同浓度西达本胺、利妥昔单抗单药或联合作用于淋巴瘤Jeko-1和Jeko-1/R细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测CD20 mRNA表达水平;Western blot法检测组蛋白H3、H4的乙酰化水平。结果25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL利妥昔单抗在48 h可呈剂量依赖式抑制Jeko-1细胞增殖,组间差异有统计学意义(F=38.533,P<0.001),且细胞增殖抑制率均高于Jeko-1/R细胞(均P<0.001)。4μmol/L、8μmol/L和16μmol/L西达本胺在48 h呈剂量依赖式抑制Jeko-1和Jeko-1/R细胞增殖,组间差异有统计学意义(F=17.968,P=0.003;F=51.456,P<0.001),但不同浓度西达本胺作用Jeko-1和Jeko-1/R细胞的增殖抑制率差异均无统计学意义(均P>0.05)。西达本胺(8μmol/L)联合利妥昔单抗(100μg/mL)分别处理Jeko-1和Jeko-1/R细胞48 h,与单药西达本胺比较,联合处理后细胞增殖抑制率均增高(P<0.001)。西达本胺在48 h呈剂量依赖式上调Jeko-1/R细胞CD20 mRNA表达和组蛋白H3和H4乙酰化水平(P<0.001)。结论西达本胺可抑制耐药B细胞淋巴瘤Jeko-1/R细胞增殖,其作用机制可能与上调组蛋白H3、H4乙酰化水平及CD20 mRNA表达有关。

13-顺式维甲酸联合IFN-α-2b治疗套细胞淋巴瘤的动物实验研究

目的评估13．顺式维甲酸（13cRA）和IFN-α-2b单用，以及二者联合应用对套细胞淋巴瘤（MCL）动物模型的抗肿瘤效应，并探讨其作用机制。方法构建MCL细胞株Jeko-1细胞重症联合免疫缺陷小鼠模型，将荷瘤小鼠随机分成阴性对照组（溶剂），高（200mg／kg）、中（100mg／kg）、低（50mg／kg）13cRA剂量组，IFN-α-2b组，不同剂量13cRA联合IFN-α-2b组，阳性对照组（硼替佐米＋利妥昔单抗＋环磷酰胺），同时进行干预治疗。定期观察荷瘤小鼠肿瘤体积变化，计算相对肿瘤增殖率、抑瘤率。采用免疫组化法检测Ki-67的表达。采用缺口末端标记法检测肿瘤组织细胞凋亡情况。采用Westernblot法检测CyclinD1、caspase．9及视网膜神经胶质瘤蛋白（Rb）等的表达水平。结果①中、高剂量13cRA组及中、高剂量13cRA联合IFN-α-2b组的相对肿瘤增殖率分别为30％、37％、32％和33％。②低、中、高剂量13cRA组或其联合IIFN-α-2b组的抑瘤率均较阴性对照组明显增高（P〈0．05），不同剂量13cRA组问、单用IFN-α-2b组抑瘤率与阴性对照组比较差异均无统计学意义（P值均〉0．05）。中剂量13cRA组或其联合IFN-α-2b组抑瘤率最高，分别为59．2％、62．6％，与阳性对照组（69．4％）差异无统计学意义（P〉0．05）。③Ki-67在各组的表达差异无统计学意义（P=-0．342）。④不同剂量13cRA组及其联合IFN-α-2b组凋亡细胞数均较阴性对照组明显增加（P〈0．05），与阳性对照组差异无统计学意义（P=O．170）；阴性对照组凋亡细胞数与IFN-α-2b组差异无统计学意义（P=0．098）。⑤不同剂量13cRA联合IFN-α-2b组与阴性对照组比较，cyclingD1及procaspase-9降低，cleavedcaspase-9升高，与阳性对照组表达相当；不同剂量13cRA组与阴性对照组比较，则未见明显差异。结论在MCL动物模型中IFN-α-2b单用并未显示出疗效；13cRA单用及其与IFN-α-2b联合应用均显示出抑制肿瘤生长效应，其作用机制可能为通过下调CyclinD1的表达而抑制细胞增殖或者激活caspase-9诱导凋亡。