LncRNA JHDM1D-AS1对MPP+诱导的帕金森细胞模型线粒体功能的机制研究

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)JHDM1D反义RNA 1(JHDM1D antisense RNA1,JHDM1D-AS1)对帕金森细胞模型线粒体功能的影响及分子机制。方法采用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)处理SH-SY5Y细胞构建帕金森细胞模型,记为MPP+组,正常细胞作为对照组(control组)。将JHDM1D-AS1 mimic和JHDM1D-AS1 siRNA分别转染至MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中,利用RT-PCR检测JHDM1D-AS1表达。流式细胞技术分析JHDM1D-AS1表达对SH-SY5Y细胞凋亡、线粒体膜电位及活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量的影响。Western blot实验分析JHDM1D-AS1表达对沉默调节蛋白1(SIRT1)表达的影响,并利用双荧光素酶报告验证两者的靶向关系。使用SIRT1激活剂Resveratrol对转染JHDM1D-AS1 mimic的细胞进一步处理,证实JHDM1D-AS1调控SIRT1对帕金森细胞线粒体的影响。结果control组JHDM1D-AS1相对表达为0.85±0.21,MPP+模型组JHDM1D-AS1相对表达为1.25±0.33,较control组增加,差异有统计学意义(t=62.017,P<0.05)。转染JHDM1D-AS1 mimic和JHDM1D-AS1 siRNA序列后,JHDM1D-AS1相对表达分别为1.63±0.38和0.72±0.17,与MPP+组比较差异有统计学意义(F=112.035,P<0.05)。MPP+组细胞凋亡率为17.64%,JHDM1D-AS1 mimic和JHDM1D-AS1 siRNA组细胞凋亡率分别为25.92%和10.74%,差异有统计学意义(F=49.052,P<0.05)。MPP+组绿色荧光强度为22.20%,JHDM1D-AS1-mimic和JHDM1D-AS1siRNA组绿色荧光强度分别为43.97%和10.65%,差异有统计学意义(F=57.390,P<0.05)。流式结果显示,MPP+组相对荧光强度为27.58%±4.25%,JHDM1D-AS1 mimic和JHDM1D-AS1 siRNA组相对荧光强度分别为45.10%±6.05%和14.82%±3.70%,差异有统计学意义(F=25.794,P<0.05)。Control组SIRTI蛋白表达为1.00±0.23,MPP+模型组SIRT1表达下调为0.70±0.27,差异有统计学意义(t=35.740,P<0.05)。转染JHDM1D-AS1 mimic和JHDM1D-AS1 siRNA后,SIRT1表达分别为0.44±0.16和1.34±0.22,与MPP+组比较差异有统计学意义(F=29.508,P<0.05)。Target Scan软件预测,JHDM1D-AS1与SIRT1序列存在结合位点,双荧光素酶实验显示,JHDM1D-AS1过表达可降低WT-SIRT1荧光素酶活性。JHDM1D-AS1过表达时线粒体膜电位降低,SIRT1激活过表达时线粒体膜电位升高,转染JHDM1D-AS1 mimic并激活SIRT1后线粒体膜电位水平回升。结论沉默JHDM1D-AS1表达可抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其作用机制可能与JHDM1D-AS1靶向调控SIRT1,进而影响帕金森细胞模型线粒体功能有关。

结直肠癌患者血清外泌体的JHDM1D-AS1水平及临床意义

目的探讨结直肠癌(CRC)患者血清外泌体的JHDM1D反义RNA 1(JHDM1D-AS1)水平及临床意义。方法利用GEPIA在线数据库分析TCGA肿瘤组织数据库中CRC组织的JHDM1D-AS1水平,Ualcan网站在线分析JHDM1D-AS1与CRC预后的关系。采用实时定量PCR(qPCR)检测119例CRC患者血清外泌体的JHDM1D-AS1水平并以93例健康体检者和34例良性肠道疾病患者为参考采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清外泌体的JHDM1D-AS1水平鉴别CRC的效能,根据临床病理特征和随访资料结合Cox比例风险回归模型来进一步分析血清外泌体的JHDM1D-AS1水平在CRC中的临床意义。结果CRC组织(275例结肠癌和92例直肠癌)的JHDM1D-AS1水平均高于正常组织(P<0.05),且组织JHDM1D-AS1水平仅与结肠癌的总生存期(OS)有关,其中高JHDM1D-AS1水平者的OS较差(P<0.05)。119例CRC患者血清外泌体的JHDM1D-AS1水平为2.652±0.882,高于健康体检者的1.267±0.442和良性肠道疾病患者的1.175±0.362(P<0.05),ROC曲线分析显示CRC对比健康对照和良性肠道疾病的血清外泌体JHDM1D-AS1的曲线下面积为0.927(95%CI:0.894~0.959,最优截断点1.970的诊断灵敏度和特异度分别为77.31%和94.62%)和0.949(95%CI:0.918~0.981,最优截断点1.779的诊断灵敏度和特异度分别为83.19%和94.12%)。血清外泌体JHDM1D-AS1水平与CRC的肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度、TNM分期和浸润深度有关(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤位置和远处转移无关(P>0.05)。单因素分析显示血清外泌体JHDM1D-AS1水平与OS有关,其中低水平组的中位OS为57.0个月及1、3、5年总生存率分别为94.3%、82.7%和45.6%,优于高水平组的42.0个月及92.6%、61.2和11.7%(P<0.05),多因素分析发现高外泌体JHDM1D-AS1水平是OS的危险因素(OR=2.615,95%CI:1.697~4.274,P=0.004)。结论CRC患者血清外泌体JHDM1D-AS1水平升高且与恶性病理特征和预后有关,该指标有望成为CRC诊断及预后评估的潜在指标。

苦荞黄酮通过JHDM1D-AS1对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响

目的探讨苦荞黄酮通过JHDM1D反义RNA1(JHDM1D-AS1)对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响及机制。方法将心肌细胞H9c2分为Con组、缺氧/复氧(H/R)组、H/R+苦荞黄酮低剂量组、H/R+苦荞黄酮中剂量组、H/R+苦荞黄酮高剂量组、H/R+pcDNA组、H/R+pcDNA-JHDM1D-AS1组、H/R+苦荞黄酮+si-NC组、H/R+苦荞黄酮+si-JHDM1D-AS1组;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹(Western Blot)法检测蛋白表达;试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测JHDM1D-AS1和miR-421的表达水平;双荧光素酶报告实验检测JHDM1D-AS1和miR-421的靶向关系。结果缺氧/复氧诱导的心肌细胞的凋亡率升高,Bax表达水平升高,Bcl-2表达水平降低,SOD活性降低,MDA水平升高,JHDM1D-AS1表达水平降低,miR-421表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);不同剂量苦荞黄酮处理后,心肌细胞凋亡率降低,Bax表达水平降低,Bcl-2表达水平升高,SOD活性升高,MDA水平降低,JHDM1D-AS1表达水平升高,miR-421表达水平降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。过表达JHDM1D-AS1后,心肌细胞凋亡率降低,Bax表达水平降低,Bcl-2表达水平升高,SOD活性升高,MDA水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。JHDM1D-AS1靶向调控miR-421;抑制JHDM1D-AS1逆转了苦荞黄酮对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响。结论苦荞黄酮通过调控JHDM1D-AS1/miR-421抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤。

Jhdm1d在小鼠胚胎发育中后期的表达及表观调控研究

本研究通过实时定量PCR(q RT-PCR)和免疫组织化学等技术,分析了Jhdm1d基因在小鼠胚胎发育中后期的表达模式。q RT-PCR结果显示,在胚胎发育中后期,Jhdm1d基因在各组织中的表达量明显不同,Jhdm1d在E12.5时期的脑和肝组织中表达最高,而在舌和肺组织中表达最低;在E15.5时期的肝脏组织中该基因的表达量最高,在肺和肾组织中的表达最低;在E18.5时期各组织中的表达均普遍较低。同时利用免疫组织化学的方法分析其在E15.5时期的表达,结果显示Jhdm1d在蛋白水平上的表达与定量结果基本相符。同时,亚硫酸氢盐测序的结果说明Jhdm1d的表达不受甲基化的影响。

Jhdm1d 在小鼠胚胎发育中后期的表达及表观调控研究

本研究通过实时定量 PCR （qRT-PCR）和免疫组织化学等技术，分析了 Jhdm1d 基因在小鼠胚胎发育中后期的表达模式。qRT-PCR 结果显示，在胚胎发育中后期，Jhdm1d 基因在各组织中的表达量明显不同，Jhdm1d 在 E12.5时期的脑和肝组织中表达最高，而在舌和肺组织中表达最低；在 E15.5时期的肝脏组织中该基因的表达量最高，在肺和肾组织中的表达最低；在 E18.5时期各组织中的表达均普遍较低。同时利用免疫组织化学的方法分析其在 E15.5时期的表达，结果显示 Jhdm1d 在蛋白水平上的表达与定量结果基本相符。同时，亚硫酸氢盐测序的结果说明 Jhdm1d 的表达不受甲基化的影响。