基于转录组测序的剑白香猪表皮颜色相关miRNA筛选与鉴定

【目的】对剑白香猪黑色和白色表皮组织进行转录组测序,筛选出对黑色素生成起调节作用的miRNA,为进一步研究miRNA对剑白香猪表皮颜色形成的调控机制提供理论依据。【方法】以剑白香猪黑色和白色表皮组织为试验材料进行转录组测序,以|log2FoldChange|≥1且错误发现率(FDR)≤0.05为标准,采用DESeq2筛选差异表达miRNA,使用miRanda和RNAhybrid预测差异表达miRNA靶基因并进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,构建差异表达miRNA、靶基因和KEGG信号通路互作网络,利用实时荧光定量PCR对转录组测序结果进行验证。【结果】从剑白香猪黑色和白色表皮中鉴定出280个已知miRNA和618个新miRNA,筛选出17个差异表达miRNA,白色表皮较黑色表皮有10个miRNA上调表达,7个miRNA下调表达。共预测获得1327个靶基因,GO功能注释分析结果显示,在生物学过程中,差异表达miRNA靶基因主要涉及上皮发育、细胞增殖和分解代谢过程等条目;在细胞组分和分子功能中,主要涉及细胞质、细胞质囊泡、ATP结合和催化活性等条目。KEGG信号通路富集结果显示,靶基因在磷脂酰肌醇信号系统、黑色素生成和细胞色素P450等信号通路富集,其中ssc-miR-615靶基因包括CALM3、CREBBP、FZD5和DVL2,其富集通路均与表皮色素沉着有关,ssc-miR-221-3p靶基因TYRP1和ssc-miR-224靶基因RAB23富集的通路与黑色素生成有关。选取7个差异表达miRNA与靶基因TYRP1和RAB23进行实时荧光定量PCR验证,结果表明差异表达miRNA的表达变化与转录组测序分析的变化趋势一致,TYRP1和RAB23在剑白香猪黑色表皮中的表达量极显著高于白色表皮(P<0.01)。【结论】ssc-miR-615、ssc-miR-221-3p和ssc-miR-224是影响剑白香猪表皮颜色的候选基因,可能对剑白香猪表皮的黑色素形成有重要影响。

基于基因组SNP和ROH的剑白香猪群体遗传结构解析

旨在从分子水平分析剑白香猪的群体结构以及遗传多样性,对剑白香猪的种质资源鉴定和保护提供技术支持。本研究利用Porcine SNP50 BeadChip(Illumina,United States)芯片对138头剑白香猪的全基因组SNP进行扫描,通过对主成分、遗传距离、亲缘关系和公猪血统进行分析,研究剑白香猪的群体结构;通过ROH分析,确定剑白香猪的遗传多样性。结果显示,此剑白香猪群体无明显分层,但大致可以分为3个部分,群体内的遗传距离平均值约为0.273,所有公猪划分为4个血统;剑白香猪群体共检测出2893个ROHs,平均每个个体约有21个ROHs,平均ROH长度约为7.18 Mb,平均近交系数(F_(ROH))为0.27%,表明剑白香猪近交积累较少。通过多种分析表明,该群体家系数量适中,个别家系公畜数量较少,个体间亲缘关系中等,近交程度较低,群体的遗传多样性较高。本研究在基因组水平分析了剑白香猪的群体遗传结构和遗传多样性,为剑白香猪群体复壮和种业安全措施制定提供了分子依据。

miR-2366靶向DCT基因调控香猪黑色素细胞黑色素生成的分子机制研究

【目的】明确miR-2366通过靶向作用多巴色素异构酶基因(DCT)对黑色素细胞中黑色素生成的影响,为解析剑白香猪“两头乌”毛色的形成机制打下理论基础。【方法】以剑白香猪为研究对象,通过酶解法测定不同毛色皮肤组织总黑色素提取率,利用碱溶法测定不同颜色毛发中不同种类黑色素的含量,以实时荧光定量PCR检测miR-2366和DCT、TYR和TYRP1基因在不同毛色皮肤组织中的表达情况;根据miR-2366与DCT基因的靶向关系,人工合成双荧光素酶报告载体(pmirGL0-DCT-3’-UTR-wt和pmirGL0-DCT-3’-UTR-mut)及miRNA-2366过表达载体mimic、抑制载体inhibitor和阴性对照NC,分别转染剑白香猪黑素细胞后,通过实时荧光定量PCR和Westernblotting检测DCT、TYR和TYRP1基因的相对表达量及其蛋白表达水平,并以碱溶法检测转染黑色素细胞中的总黑色素含量。【结果】在剑白香猪黑色皮肤组织中,总黑色素提取率极显著高于白色皮肤组织(P<0.01,下同);在黑色毛发中,总黑色素、棕黑色素和真黑色素含量也极显著高于白色毛发;在黑色皮肤组织中,miR-2366的相对表达量极显著低于白色皮肤组织,而DCT、TYR和TYRP1基因的相对表达量极显著高于白色皮肤组织。在转染试验中,miR-2366mimic能极显著下调DCT、TYR和TYRP1基因表达,显著降低DCT、TYR和TYRP1蛋白表达(P<0.05);导致黑色素细胞中黑色素含量极显著降低36.0%;而miR-2366 inhibitor极显著上调DCT、TYR和TYRP1基因及其蛋白的表达,促使黑色素细胞中黑色素含量极显著升高20.0%。【结论】miR-2366通过靶向负调控DCT基因表达而调节黑色素细胞中的黑色素含量,进而调控剑白香猪毛色的形成,提示miR-2366对黑色素的生成具有调控作用。

不同日龄久仰香猪、剑白香猪与长白猪空肠粘膜组织学观察

应用组织学方法分别对14、28日龄贵州久仰香猪、剑白香猪和长白猪空肠前段的形态变化进行比较研究。结果表明:久仰香猪的绒毛最长,绒毛长度/隐窝深度的比值最高。同一日龄不同品种间比较,在宽度上14日龄剑白香猪和长白猪之间与28日龄剑白香猪和久仰香猪之间差异不显著(P>0.05);绒毛数量为14日龄久仰香猪和剑白香猪之间差异不显著(P>0.05);隐窝深度为28日龄剑白香猪和久仰香猪之间差异不显著(P>0.05)。同一品种不同日龄之间比较,3种猪从14日龄到28日龄绒毛的长度都变短,且差异显著(P<0.01);绒毛数量从14日龄到28日龄均有增加,但剑白香猪差异不显著(P>0.05);剑白香猪和长白猪绒毛宽度出现增加,而久仰香猪绒毛宽度降低,但差异不显著(P>0.05);隐窝深度从14日龄到28日龄均出现加深,但久仰香猪加深显著(P<0.01)。久仰猪的绒毛长度/隐窝深度的比值最高(14日龄为9.39±3.65;28日龄为5.42±1.83)。

剑白香猪5世代肉质的常规指标测定

用 0世代剑白香猪作对照 ,对剑白香猪Ⅰ系和Ⅱ系 8月龄 5世代作肉质常规指标测定 ,结果表明 :其肉色正常 ,大理石纹适中 ,5世代与 0世代剑白香猪pH1差异极显著 (P <0 .0 1)、pH2 4差异显著 (P <0 .0 5 ) ,失水率和熟肉率差异不显著 (P>0 .0 5 ) ,各指标均在常值范围内。

剑白香猪血液生理指标研究

[目的]研究剑白香猪不同发育阶段血液指标特性。[方法]选取2、4和6月龄剑白香猪各10头,共30头,公母各半,测定主要血液生理指标,并应用SPSS10.0软件进行统计分析。[结果]相同性别不同月龄猪只的大多数血液生理指标之间差异极显著(P<0.01)或差异显著(P<0.05);相同月龄不同性别之间,除2月龄的红细胞比值,4月龄的红细胞平均血红蛋白浓度、淋巴细胞比例,6月龄的血红蛋白浓度之间差异显著外(P<0.05),其他血液学指标均差异不显著。[结论]该研究为剑白香猪品种改良以及医学研究提供了理论依据。

久仰香猪染色体C-带多态性研究

以久仰香猪为试验组 ,剑白香猪、从江香猪和长白猪为对照组 ,用外周血淋巴细胞培养 ,C 分带处理。结果表明 :各染色体均不同程度显带 ,发生在着丝粒、次缢痕及其附近和长臂上 ,呈圆形或椭圆形且存在多态性 ;染色体C 带在细胞周期和猪的不同生长时期具有相对稳定性 ;染色体C 带大小与染色体长度无关 ;在个体内细胞间同一染色体C 带大小具有高度可重复性 ;大型带发生在Y 染色体、1、2、13～ 16、18号染色体上 ,Y 染色体C带几乎占据整个长臂 ,呈椭圆形 ;中型带发生在 3～ 8、12、17号染色体上 ;小型带发生在 9、10、11、X染色体上 ;香猪类型之间显带频率、相对长度和面积均较高 ,长白猪相对较低 ,说明香猪异染色质含量比长白猪高。

贵州香猪染色体核型研究

以贵州香猪(久仰香猪、剑白香猪、从江香猪)为试验组,长白猪为对照组,用外周血淋巴细胞培养对其染色体核型进行研究。结果表明,各香猪类型及长白猪淋巴细胞染色体数均为2n=38;香猪染色体核型组成为10sm+4st+12m+12t,长白猪则为8sm+4st+14m+12t;性染色体雌性均为XX,雄性均为XY,X、Y属中着丝粒染色体,Y是中着丝粒染色体相对长度最短的一条;3,5,6,7和9号染色体的臂比值各香猪类型与长白猪相比,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);1,5,6,8,9和11号染色体的相对长度各香猪类型与长白猪相比,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);香猪类型间也存在一定差异。

7世代剑白香猪生长发育及繁殖性能测定

在相同饲养管理条件下,对7世代贵州剑白香猪两品系生长发育和繁殖性能进行测定.结果显示,两品系2～6月龄体重、体高、胸围两两差异不显著 (P＞0.05);2月龄体长、腹围两两差异不显著(P＞0.05);6月龄体长差异显著(P＜0.05),腹围差异极显著(P＜0.01);产仔数、初生个体重、初生窝重、断奶个体重、断奶仔猪数两两差异不显著(P＞0.05);泌乳力、断奶窝重两两差异极显著(P＜0.01),日增重低;7世代剑白香猪体重体尺均小于零世代.全白毛系,体型矮小、生长发育缓慢,是较为理想的实验动物选育群.

剑白香猪8世代的肉质常规指标测定

在同等饲养管理条件下,用同龄的Ⅱ系剑白香猪作对照,按照GB3038—82种猪档案记录规定方法对8世代8月龄剑白香猪Ⅰ系肉质常规指标进行测定。结果表明,其肉色正常,大理石纹适中,pH1和pH24两品系差异不显著(P>0.05);剑白香猪Ⅰ系失水率是(17.13±2.34)%、熟肉率是(60.54±1.29)%、滴水损失是(1.69±0.17)%、嫩度是(3.21±0.17)kg;剑白香猪Ⅱ系失水率是(20.88±1.92)%、熟肉率是(62.43±2.32)%、滴水损失是(2.29±0.28)%、嫩度是(3.19±0.13)kg,各项指标差异均不显著(P>0.05)。说明剑白香猪肉质好,是加工高档肉产品的最佳原材料。

剑白香猪各组织中肥大细胞的观察研究

目的:试验旨在通过对6月龄剑白香猪肥大细胞的观察,以期了解肥大细胞在剑白香猪不同组织器官的数量、分布及形态。方法:采集剑白香猪心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、小肠等部位样品用多聚甲醛和carnoy’s液固定后,用甲苯胺蓝染色法检测各组织中肥大细胞数量、分布及形态,并用SPSS13.0软件进行统计分析。结果:试验表明,肥大细胞数量在不同性别间无明显差异;Carnoy’s固定液是测定猪各组织器官MC的较理想固定液;肥大细胞在各种组织中分布及形态复杂多样。本试验可为剑白香猪肥大细胞的进一步研究提供参考数据。

剑白香猪染色体核型及其C-带多态性研究

以剑白香猪为材料,采用外周血淋巴细胞短期培养,对其体细胞染色体核型及其C-带进行分析。结果表明,剑白香猪体细胞染色体数2n=38,染色体类型为12m+10sm+4st+12t;C-带均存在多态性,但又存在共性。各染色体均不同程度显带,发生在着丝粒处或长臂上,呈现圆形或椭圆形;在1号、2号、13～18号和Y染色体C-带呈强阳性,出现频率最高,表现为大型带,Y染色体C-带几乎占据了整个长臂,呈椭圆形;中型带发生在3～8号和12号,呈阳性;小型带发生在9号、10号、11号和X染色体上,呈弱阳性。

剑白香猪葡萄糖转运蛋白4 cDNA的克隆及序列分析

为了在基因水平上给动物的营养代谢研究提供基础性资料,为系统研究剑白香猪这一优质猪种提供参考,以剑白香猪肌肉组织中的总RNA为模板,克隆了剑白香猪的GLUT-4cDNA序列,并对其序列进行了分析。结果表明:克隆片段总长为1 616bp,包含一个长1 530bp的开放阅读框(ORF),编码509个氨基酸残基的蛋白;该蛋白的相对分子质量为54.809 4kDa,等电点为6.98,包含30个功能位点,即3个N-糖基化位点、1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酰胺化位点、12个N-豆蔻酰化位点、1个糖转运蛋白signature 1位点和1个糖转运蛋白signature 2位点;剑白香猪与牛、兔、小家鼠、人、马、黑猩猩、褐家鼠、非洲爪蟾GLUT-4基因编码序列的同源性分别为91.76%、90.52%、87.91%、90.52%、92.29%、90.46%、87.52%和65.82%,氨基酸序列的同源性分别为94.7%、95.68%、94.11%、95.09%、94.89%、95.28%、94.5%和68.31%。

剑白香猪两品系生产性能测定

通过测定剑白香猪Ⅰ和Ⅱ系的生产性能,结果表明,各项指标差异不显著(P>0.05),仅初生重差异显著(P<0.05)。剑白香猪体躯矮小,生长缓慢;性成熟早,母猪母性好,护仔行为明显;内脏器官与成人器官相接近;胴体品质良好,肉色呈鲜红色,大理石纹适中,pH值正常,未出现PSE肉和DFD肉,失水率分别为21.88%、19.63%;滴水损失分别为1.89%、2.26%;熟肉率分别为62.07%、61.51%。剑白香猪肉质好,是加工高档猪肉产品的原材料。

剑白香猪两品系染色体核型及其C带分析

采用外周血淋巴细胞培养技术及C带显带技术，对剑白香猪Ⅰ系和Ⅱ系的染色体核型及C带进行了研究。结果表明，剑白香猪两品系细胞染色体数均为2n=38，二者的第3、4、7、9、10、11号染色体的部分核型参数差异显著（P〈0．05）或极显著（P〈0．01），其余染色体参数差异不显著（P〉0．05）；核型似近系数为0．9692，进化距离为0．0313，说明亲缘程度很高；染色体条比值均为1．01～1．05，其纯合性高；染色体C带发生位点均一致。C带的发生频率、带型特征具有多态性。

热应激对剑白香猪相关指标的影响

通过对剑白香猪(Ⅰ系、Ⅱ系)在7、8月热应激条件下的繁殖性状和生物学特性测,结果表明,热应激条件下,总产仔数、产活仔数偏低,Ⅰ系、Ⅱ系平均产活仔猪分别为46.4%和8.0%;Ⅰ系中,公猪走动的占90.0%,母猪走动的占30.0%,生长发育猪走动的占92.1%;Ⅱ系中,公猪走动的占80.0%,母猪走动的占36.4%,生长发育猪走动的占79.1%;猪的心跳加快;呼吸频率增加;饮水量增加;喜食青料;腹泻、皮肤患病率增加,Ⅰ系、Ⅱ系腹泻的发病率分别是61%、29%,皮肤病的发病率分别是19%、67%。