基于RNA-Seq技术筛选姜曲海猪子宫和卵巢发育相关基因

母猪的子宫和卵巢组织发育情况直接影响母猪的繁殖性能,进而对养猪业的经济效益造成重大影响。为探究姜曲海猪子宫和卵巢发育的分子机理,本研究选取1月龄和8月龄姜曲海猪各3头,利用转录组测序技术(RNA-Seq)对子宫和卵巢组织进行测序,通过生物信息学手段筛选差异表达基因并进行基因本体(Gene ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto ncyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,再与猪数量性状基因座(Quantitative trait locus,QTL)数据库比对后鉴定出重要的候选基因。结果显示,1月龄和8月龄姜曲海猪子宫组织中有1688个差异表达基因,表达上调和下调的基因各844个;卵巢组织中存在3833个差异表达基因,其中2831个表达上调,1002个表达下调。富集分析结果显示这些差异表达基因主要显著富集于动物器官发育、组织发育和细胞分化等生物学过程。本研究在子宫和卵巢组织中分别筛选出11个和31个与发育性状有关的候选基因,其中共有的候选基因有6个,分别为LHFPL1、MTUS2、LIF、RBP4、EPHB2和TESC。本研究结果为姜曲海猪子宫和卵巢发育分子层面的研究提供了参考,也为今后姜曲海猪繁殖性状的分子改良提供了新的研究方向。

姜曲海猪瘦肉型品系(零世代)仔猪背最长肌肌内脂肪酸组成及含量的研究

选取姜曲海猪瘦肉型品系(零世代)仔猪24头,按初生及15、30、45、60、75日龄分成6个阶段,每日龄段4头,分别屠宰后取3～5 g背最长肌,经甲酯化后用气相色谱法测定各日龄段的肌内脂肪酸含量。结果表明:饱和脂肪酸含量随着日龄的增长(初生～60日龄)而逐渐减少,60～75日龄又有所升高。不饱和脂肪酸含量在断奶前较稳定(600 mg·g-1左右),断奶～60日龄降至505.1 mg·g-1,此后又升高至75日龄的620.0 mg·g-1;不饱和脂肪酸(主要为单不饱和脂肪酸)含量较高,这是该品系猪肉质优良的种质特性指标之一。

基于高通量测序分析肺炎支原体感染姜曲海猪肺组织miRNA表达谱

为探明姜曲海猪感染肺炎支原体后肺组织miRNA(microRNA)表达谱和分子机制,选取50日龄姜曲海猪为实验猪,随机分成感染组和对照组,人工感染肺炎支原体28 d后,采集肺部组织,进行高通量miRNA测序,采用生物信息学软件进行miRNA鉴定和靶基因预测。结果显示:感染组和对照组的肺组织分别筛选到14265786条和14000588条小RNA纯净序列(clean reads)。与对照组相比,感染组中筛选到73个显著差异表达的miRNAs,其中39个表达上调,34个表达下调,从中随机选取4个miRNAs进行定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)验证,感染组和对照组的表达水平与测序结果基本一致。73个差异表达miRNAs预测到1685个靶基因和4220个靶位点,靶基因预测筛选到8个与免疫调控相关的miRNAs。靶基因GO(gene ontology)分析显示,miRNA广泛参与生物过程、细胞组成和分子功能的调控。靶基因KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析显示,miRNA参与调控细胞凋亡、ECM受体相互作用、粘附斑通路等信号通路。本研究通过高通量测序获得姜曲海猪感染肺炎支原体后肺组织miRNA表达谱,通过生物信息学分析筛选到与免疫调控相关的miRNAs和信号通路,为进一步阐明姜曲海猪的肺炎支原体感染机制奠定了基础。

生长肥育阶段姜曲海猪饲粮中适宜粗纤维水平的研究

研究旨在评价饲粮不同粗纤维(CF)水平对姜曲海猪生长性能、胴体性状、肉品质以及血清生化指标的影响以探究其适宜的粗纤维需要量。选取96头体重为(27.61±2.15)kg健康姜曲海猪,随机分为4个处理,每处理4个重复,每个重复6头猪(公母各半),分别饲喂4种饲粮,粗纤维水平分别为4%(对照组)、7%、10%和13%。预饲期7 d,正试期120 d。结果表明:(1)与对照组相比,13%CF组的平均日增重和平均日采食量显著降低(P<0.05)。10%CF组的料重比与对照组没有显著差异,但结果最低,且显著低于13%CF组(P<0.05)。(2)7%CF组、10%CF组和13%CF组的板油比例均显著低于对照组(P<0.05),10%CF组和13%CF组的平均背膘厚显著低于对照组(P<0.05)。(3)与对照组相比,10%CF组显著降低了背最长肌剪切力(P<0.05),13%CF组显著降低了大理石评分(P<0.05),7%CF组、10%CF组和13%CF组背最长肌粗脂肪含量显著降低(P<0.05)。(4)10%CF组的谷草转氨酶活性显著低于对照组(P<0.05),3个试验组的乳酸脱氢酶活性均显著低于对照组(P<0.05)。与对照组相比,10%CF组和13%CF组显著降低了血清甘油三酯水平(P<0.05)、显著提高了血清肌酐和葡萄糖水平(P<0.05),7%CF组显著降低了血清胆固醇水平(P<0.05),13%CF组显著降低了血清高密度脂蛋白水平(P<0.05),3个试验组均显著降低了血清低密度脂蛋白水平(P<0.05)。研究结果显示,姜曲海猪具有较强的耐粗饲能力,其生长育肥期饲粮粗纤维水平以10%为宜。

感染肺炎支原体姜曲海猪肺组织差异表达circRNAs的筛选与分析

为探明姜曲海猪感染猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)后肺组织环状RNA(circular RNA,circRNA)差异性表达谱及其在抗Mhp感染中的作用,试验以姜曲海猪为研究对象,分为感染组和对照组,人工感染Mhp 28 d后,解剖采集肺组织,采用高通量测序和生物信息学软件分析circRNA的表达情况。测序数据比对参考猪基因组序列,共鉴定到23632个circRNAs,差异表达circRNAs为213个,其中97个上调,116个下调。随机选择4个差异表达circRNAs进行实时荧光定量PCR验证,检测结果与测序结果基本一致。差异表达circRNA来源基因可注释到包括抗原加工递呈、溶酶体、白细胞跨内皮迁移等免疫应答信号通路。circRNA-miRNA-mRNA靶标关系分析显示,筛选到海绵结合miRNA数量最多的3个差异表达circRNAs,分别为:circRNA-17284(21个)、circRNA-04848(19个)和circRNA-17270(19个);预测到6个与免疫调控相关的靶向miRNAs,分别为:ssc-miR-4331、ssc-miR-370、ssc-miR-328、ssc-miR-30c-3p、ssc-miR-122和ssc-miR-125b。本研究测定了感染Mhp的猪肺组织circRNA表达谱,筛选到与免疫调控相关的差异表达circRNA,这有助于阐明姜曲海猪对Mhp的易感机制,为抗病育种研究提供了参考依据。

猪Leptin基因多态性及其与产仔性状的相关性分析

试验旨在探究Leptin基因对猪产仔性状的影响,为其新品种持续选育提供遗传学依据。参考GenBank发布的猪Leptin基因DNA序列(登录号:U66254、AF026976)设计3对引物,采用PCR-SSCP技术分析Leptin基因在苏姜猪和姜曲海猪中的单核苷酸多态性(SNP),并用统计学方法分析基因座多态性与产仔性状的相关性。结果发现,Leptin基因在苏姜猪、姜曲海猪群体中均具有多态性,检测到3种基因型:AA、AB和BB;测序结果发现,编码区第3 469位碱基处发生单碱基突变(T3469C),为同义突变。χ2适合性检验显示,2个猪种Leptin基因型分布处于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。多态信息含量(PIC)分析显示,苏姜猪为中度多态,姜曲海猪为低度多态。Leptin基因型与产仔性状关联分析显示,不同基因型间产仔性状差异不显著(P>0.05),但T3469C位点AB基因型平均产仔数较AA和BB基因型高,初步推断Leptin基因T3469C位点可能是影响猪产仔性状潜在的遗传标记,建议做进一步的研究。

藏猪与姜曲海猪杂交对其后代生产性能的影响研究

为了更好地利用高原藏猪肉质鲜嫩、风味独特的优点发展江苏地区特色养猪业,试验将藏猪分别进行纯繁(藏猪公猪与藏猪母猪选配,记为T♂×T♀组)和杂交(姜曲海猪公猪与藏猪母猪选配,记为J♂×T♀组;藏猪公猪与姜曲海猪母猪选配,记为T♂×J♀组),测定各组繁殖性能指标(窝总产仔数、窝产活仔数、出生窝重、出生个体重及45日龄断奶窝重、断奶个体重、窝断奶头数和窝断奶成活率)和F1代哺乳、保育阶段的日增重、日耗料量及育肥阶段的日增重、日耗料量及料重比,并从各组中选取6头猪进行屠宰,测定屠宰性能指标(胴体重、屠宰率、背膘厚、瘦肉重、脂肪重、瘦肉率、胴体直长和斜长)和肉品质指标(眼肌面积、肉色、大理石纹、pH_(1 h)值、系水力、剪切力)。结果表明:T♂×J♀组窝总产仔数、窝产活仔数、45日龄窝断奶头数极显著高于J♂×T♀组和T♂×T♀组(P<0.01);T♂×T♀组45日龄断奶窝重和窝断奶个体重极显著低于T♂×J♀组和J♂×T♀组的(P<0.01);三组的出生窝重、出生个体重和窝断奶成活率均差异不显著(P>0.05)。在哺乳阶段,J♂×T♀组和T♂×J♀组日增重和日耗料量均显著高于T♂×T♀组(P<0.05);在保育阶段,T♂×J♀组的日增重极显著高于J♂×T♀组和T♂×T♀组(P<0.01),J♂×T♀组的日耗料量显著高于T♂×T♀组(P<0.05),但与T♂×J♀组差异不显著(P>0.05);在育肥阶段,J♂×T♀组和T♂×J♀组日增重均显著高于T♂×T♀组(P<0.05);T♂×J♀组的日耗料量和料重比极显著低于T♂×T♀组和J♂×T♀组(P<0.01),J♂×T♀组的料重比显著低于T♂×T♀(P<0.05)。J♂×T♀组屠宰率高于T♂×T♀组(P<0.05)和T♂×J♀组(P>0.05),瘦肉率极显著高于T♂×T♀组和T♂×J♀组(P<0.01);T♂×J♀组脂肪重高于J♂×T♀组(P<0.05)和T♂×T♀组(P>0.05);3组背膘厚差异不显著(P>0.05)。T♂×T♀组和J♂×T♀组肉色极显著高于T♂×J♀组(P<0.01),J♂×T♀组大理石纹极显著高于T♂×T♀组和T♂×J♀组(P<0.01),T♂×T♀组pH1 h值显著高于J♂×T♀组和T♂×J♀组(P<0.05),J♂×T♀组系水力显著高于T♂×T♀组和T♂×J♀组(P<0.05),J♂×T♀组和T♂×J♀组剪切力显著高于T♂×T♀组(P<0.05),各组眼肌面积差异不显著(P>0.05)。说明与藏猪纯繁相比,姜曲海猪与藏猪杂交后代的繁殖性能、生长肥育性能和屠宰性能均有不同程度的提高,藏猪作为父本、姜曲海猪作为母本具有更好的种质利用价值。

姜曲海猪FoxO3 基因组织表达和多态性与肉质关联分析

为研究姜曲海猪FoxO3基因组织表达和遗传多态性与肉质性状的关联性,采用PCR-SSP分子标记技术,分析了112头姜曲海猪FoxO3基因第二外显子的遗传变异情况,利用实时荧光定量PCR检测姜曲海猪心脏、肝脏、脾脏、肾脏、腹脂、皮下脂肪、背最长肌、比目鱼肌、腓肠肌和半腱肌中FoxO3基因的表达量。姜曲海猪FoxO3基因第二外显子500 bp位点存在多态性,得到TT、CC及TC 3种基因型,T基因频率为0.424,表现为中度多态(PIC=0.369);试验猪群的基因频率和基因型频率都处于哈迪温伯格平衡状态(P>0.05);分析不同基因型对肉质性状的影响,FoxO3基因第二外显子多态性与猪肌内脂肪含量、剪切力性状关联显著。FoxO3基因在姜曲海猪10个组织中均有表达,FoxO3基因与肌纤维直径和肌内脂肪含量呈负相关,与肌纤维密度和剪切力呈正相关,但相关性均不显著(P>0.05)。FoxO3基因与腓肠肌肌原纤维直径相关系数分别为-0.937,与背最长肌肌节长度的相关系数为-0.874。综上,FoxO3基因对姜曲海猪肉质性状发育有一定的影响,可作为肉质性状候选基因进行深入研究。

姜曲海猪mtDNA D-loop序列遗传多样性研究

为研究姜曲海猪保种群线粒体DNA遗传多样性及种质特性,选取姜曲海猪保种群中58个体进行mtDNA D-loop高变区序列扩增测序,获得的长度为427 bp有效序列基因片段,然后对有效序列遗传多样性进行了分析。结果表明:(1)姜曲海猪的mtDNA D-loop高变区扩增测序的有效序列基因片段中,碱基A+T含量为63.2%,G+C含量为36.8%,碱基A+T含量明显高于G+C含量;(2)在58个序列中共有15个变异位点,其中T/C转换10次、G/A转换3次、A/T颠换1次、C/A颠换1次;(3)检测出单倍型3个,总的单倍型多样性和核苷酸多样性指数分别为0.686和0.0052,表明姜曲海猪种群遗传多样性偏低,姜曲海猪保种群母系来源单一;(4)单倍型间遗传距离计算结果表明,种群内3个单倍型之间的平均遗传距离在0.003~0.005之间,单倍体间的遗传距离较近,表明保种群近交的情况比较严重。

姜曲海猪FSHβ-亚基基因PCR-SSCP分析

用 PCR- SSCP方法对 15 2头姜曲海猪的 FSHβ-亚基基因进行了分型。结果表明 ,FSHβ-亚基基因在姜曲海猪中有 AA、AB、BB三种基因型 ,其频率分别为 0 .2 89、0 .493和 0 .2 17;A基因频率为 0 .5 36 ,B基因频率为 0 .46 4。A、B基因频率方差及两基因频率协方差分别为 0 .0 0 1、0 .0 0 1和 - 0 .0 0 1。A基因频率的群体估计值的 95 %置信区间为 [0 .473,0 .5 99],B基因频率对应为 [0 .40 1,0 .5 2 7];基因杂合度为 0 .498。经检验 ,该座位处于哈迪 -温伯格平衡状态。

姜曲海猪的染色体核型、C带和银染核仁组成区(Ag-NORs)

应用外周血淋巴细胞培养技术研究姜曲海猪的染色体核型、C带和Ag-NORs,结果表明:姜曲海猪有38条染色体,属XY型。常染色体可分为四组:亚中部着丝点染色体(sm),亚端部着丝点染色体(st),中部着丝点染色体(m),端部着丝点染色体(t),而性染色体(X和Y染色体)归于中部着丝点染色体。 C带研究表明:1号和13—18号染色体着丝点以及Y染色体的长臂呈现深染,而其它染色体的着丝点呈浅染。 Ag-NORs研究表明:8号和10号染色体的次缢痕处出现Ag-NORs,平均每细胞有3.23个Ag-NORs。

姜曲海猪瘦肉型品系(零世代)早期背最长肌超微结构的研究

选择姜曲海猪瘦肉型品系(零世代)仔猪24头于0,15,30,45,60,75d进行屠宰,取背最长肌做超薄切片,对肌原纤维直径、肌节、A带、I带和H带进行测量分析。结果表明,肌原纤维直径从出生至15日龄期间生长迅速,15日龄时肌原纤维直径比初生时几乎增加了1.5倍,此后各日龄段增长缓慢,到75日龄已接近成熟;肌节长度到45日龄时已达到1649nm,基本分化成熟;A带长度从出生到60日龄呈逐渐增加趋势,60日龄时达到1346nm基本分化成熟;而I带和H带长度不随年龄增长而增加,说明I带和H带长度在胚胎期已基本成熟而稳定;研究发现各部分成熟的先后顺序为:I带(胚胎期)>肌节(45日龄)>A带(60日龄)>肌原纤维直径(75日龄)。

姜曲海猪头部铸型及内脏器官浸渍标本的制作

姜曲海猪头部铸型标本是采用一种特殊技术将填充剂(高分子化合物)注入动物体管道内,其硬化后将其他组织腐蚀清除,以填充物显示动物体器官管道立体构筑的特殊标本,填充剂加入不同的颜料,使各种管道呈现出不同色彩。此种技术能充分展示动物体各解剖结构的形态,并且能做到形态结构真实、管道充盈、三维立体感强、构形美观、色泽鲜明、层次清晰,不仅对医学形态学有教学、科研价值,同时也为临床外科手术及介入治疗的发展提供形态学依据。本文通过取材、标本的准备、灌注、洗涤、保存等过程成功制作1件姜曲海猪头部铸型标本以及若干浸渍标本,存放于江苏农牧科技职业学院动物解剖标本馆,并应用于社会科普教育和动物解剖课程的现场教学。

姜曲海杂交猪活体性状及屠宰性状的测定分析

笔者对姜曲海母猪分别与长白公猪和杜洛克公猪杂交猪———姜长猪和姜杜猪的活体性状及屠宰胴体性状指标进行了测定分析。结果表明:在生长性能方面,姜杜猪与姜长猪的日增重间无显著差异(P>0.05),姜杜猪料重比(2.48∶1)低于姜长猪(2.88∶1);在120日龄、150日龄、180日龄3个阶段的活体背膘厚和体尺指标中,姜杜猪的活体背膘厚小于姜长猪。其中,120日龄和150日龄显著低于姜长猪。姜杜猪与姜长猪的胸围间无显著差异(P>0.05)。姜杜猪的体高显著高于姜长猪(P<0.05)。姜杜猪120日龄时体长显著(P<0.05)高于姜长猪,此后,姜长猪体长生长加快,至150日龄时显著高于姜杜猪(P<0.05),至180日龄时,2种杂交猪间无显著差异(P>0.05)。在胴体性状方面,姜杜猪与姜长猪的屠宰率、平均背膘厚、眼肌面积间差异不显著(P>0.05),胴体瘦肉率姜杜猪显著高于姜长猪(P<0.05)。在肉质方面,姜杜猪肉的肉色、大理石纹、失水率与姜长猪肉间无显著差异(P>0.05),pH1值和剪切力显著小于(P<0.05)姜长猪肉,表明姜杜猪肉质较嫩。