瑞戈非尼联合健脾消癌方对结直肠癌的临床疗效及免疫功能的影响

目的研究瑞戈非尼联合健脾消癌方治疗结直肠癌的临床疗效及其对免疫功能的影响。方法采用随机数字表法将2022年2月至2023年12月南京中医药大学附属南京医院(南京市第二医院)肿瘤科接收的结直肠癌患者70例进行分组,观察组(35例)服用瑞戈非尼联合健脾消癌方,对照组(35例)予以瑞戈非尼口服,均用药28 d。评价总有效率;检测治疗前后T淋巴细胞(CD3^(+))、辅助性T细胞(CD4^(+))、CD4^(+)/细胞毒性T细胞(CD8^(+))、糖类抗原(CA125、CA19-9、CA242)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α);统计不良反应(恶心呕吐、手足皮肤反应、腹泻、肝肾功能等)。结果观察组总有效率为57.14%,高于对照组的42.86%(P<0.05)。治疗后,两组患者CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平均明显高于治疗前(P<0.05),且观察组CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)均高于对照组(P<0.05)。治疗后,两组CA125、CA19-9、CA242、CEA水平均低于治疗前(P<0.05),且观察组CA125、CA19-9、CA242、CEA水平均低于对照组(P<0.05)。治疗后,两组血清IL-6、IL-10、TNF-α水平均低于治疗前(P<0.05),且观察组IL-6、IL-10、TNF-α均低于对照组(P<0.05)。治疗期间,两组不良反应总发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论瑞戈非尼联合健脾消癌方对结直肠癌有较好疗效,可减轻炎性反应、调节免疫能力、降低肿瘤标志物水平,且不良反应少,值得临床推广。

健脾消癌方对缺氧微环境诱导的结肠癌细胞生物学行为影响及抑癌机制研究

目的研究健脾消癌方对缺氧微环境下结肠癌细胞生物学行为的影响,并探讨其抑癌机制。方法将对数生长期的结肠癌SW620细胞随机分为健脾消癌方组(10%健脾消癌方的含药血清培养)和对照组(10%的空白血清培养),两组同时在缺氧环境下诱导培养14 d。采用Real-time PCR和Western blot检测两组结肠癌细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、VEGF、Bcl-2、Caspase-3、MMP-9、Survivin mRNA及蛋白的表达;MTT法检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡。结果与对照组比较,健脾消癌方组结肠癌SW620细胞HIF-1α、VEGF、Bcl-2 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05),Caspase-3 mRNA和蛋白水平升高(P<0.05);健脾消癌方组结肠癌SW620细胞在48、72、96 h时细胞存活率降低(P<0.01),迁移和穿透室膜细胞数降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05)。结论健脾消癌方能下调缺氧微环境中结肠癌细胞HIF-1α水平,间接影响其下游靶基因的表达,抑制结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡、减弱细胞的迁移,发挥抗癌作用。

健脾消癌方干预肠癌细胞外泌体对巨噬细胞TGF-β1/Smad信号通路的调控作用研究

目的:研究健脾消癌方干预肠癌细胞外泌体对巨噬细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响。方法:将50只大鼠随机分为正常组和健脾消癌方含药血清组,每组25只,健脾消癌方含药血清组以健脾消癌方水煎液灌胃,正常组大鼠每日以等量蒸馏水灌胃,1次/d,连续7 d后获取含药血清和不含药血清。将对数生长期的HCT116细胞分为JPXAF组、WY组,JPXAF组予20%健脾消癌方含药血清干预,WY组以20%不含药血清干预,采用超速离心法提取外泌体,JPXAF组、WY组提取的外泌体分别命名为JPXAF-Exo、WY-Exo。将THP-1巨噬细胞分为对照组和外泌体组,对照组进行常规培养,外泌体组予HCT116细胞外泌体干预。采用反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞MMP2 mRNA、MMP9mRNA、TNF-αmRNA、PD-L1 mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达量。将THP-1巨噬细胞随机分为Control组、WY-Exo组、JPXAF-Exo组。Control组常规培养,WY-Exo组、JPXAF-Exo组分别予WY-Exo、JPXAF-Exo干预。采用RT-PCR法检测巨噬细胞中MMP2 mRNA、MMP9 mRNA、TNF-αmRNA、PD-L1 mRNA、TGF-β1 mRNA的表达,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测细胞TGF-βRⅡ、Smad2/3蛋白的表达水平及Smad2/3蛋白的磷酸化水平。结果:外泌体组巨噬细胞中PD-L1 mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达量均高于对照组(P<0.01);外泌体组巨噬细胞中MMP2 mRNA、MMP9 mRNA、TNF-αmRNA相对表达量与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);JPXAF-Exo组巨噬细胞MMP9 mRNA相对表达量低于Control组、WY-Exo组(P<0.05);WY-Exo组、JPXAF-Exo组巨噬细胞PD-L1 mRNA的表达明显高于Control组(P<0.01);WY-Exo组巨噬细胞TGF-β1 mRNA相对表达量明显高于Control组(P<0.01);JPXA-Exo组巨噬细胞TGF-β1 mRNA相对表达量显著低于Control组、WY-Exo组(P<0.05或P<0.01)。JPXA-Exo组巨噬细胞TGF-βRⅡ、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表达均低于WY-Exo组(P<0.01)。结论:健脾消癌方含药血清可通过外泌体抑制TGF-β1/Smad信号通路改善外泌体介导的肿瘤转移前微环境从而抑制结直肠癌的转移。

健脾消癌方干预结肠癌细胞HCT116来源外泌体中miR-21调控CAFs的活化与糖酵解的研究

目的:研究健脾消癌方干预结肠癌细胞HCT116来源外泌体中小分子含氧核糖核酸-21(miR-21)调控肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)的活化与糖酵解的作用机制。方法:采用超高速离心法收集分泌HCT116细胞来源外泌体(Exosomes,EXO);透射电镜鉴定HCT116细胞来源的外泌体形态;纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体的粒径分布范围;Western blot检测外泌体标志性蛋白TSG101、Alix、Calnexin的表达。制备健脾消癌方无外泌体含药鼠血清,采用含药血清干预HCT116细胞,RT-PCR检测miR-21的表达;收集无外泌体胎牛血清、无外泌体鼠血清、健脾消癌方无外泌体含药鼠血清干预后及miR-21 inhibitor转染后HCT116细胞来源的外泌体(HCT116外泌体1μg/mL组、空白鼠血清处理HCT116外泌体1μg/mL组、含药鼠血清处理HCT116外泌体1μg/mL组、miR-21敲除HCT116外泌体1μg/mL组),分别干预人胚肺成纤维细胞HFL-1,Western blot、RT-PCR法分别检测α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、血小板源生长因子受体-A(Platelet-derived growth factor A,PDGFRA)、丙酮酸激酶M2(Pyruvate kinase M2,PKM2)蛋白和mRNA的表达。结果:经透射电镜观察到HCT116细胞上清中提取到的外膜囊泡呈杯托样结构,粒径分析显示其直径主要分布在80 nm~200 nm之间,Western blot法检测到外泌体中标志蛋白TSG101、Alix均有表达;PKH67荧光标记的外泌体可被HFL-1细胞摄取;健脾消癌方可降低HCT116细胞来源miR-21的表达,且呈时间、浓度依赖;与空白对照组比较,HCT116外泌体1μg/mL组、空白鼠血清处理HCT116外泌体1μg/mL组α-SMA、PDGFRA、PKM2蛋白和mRNA相对表达上调(P<0.05或P<0.01);与空白鼠血清处理HCT116外泌体1μg/mL组比较,健脾消癌方含药鼠血清处理HCT116外泌体1μg/mL组、miR-21敲除HCT116外泌体1μg/mL组α-SMA、PDGFRA、PKM2蛋白和mRNA相对表达下调(P<0.05或P<0.01)。结论:HCT116细胞来源外泌体中miR-21可诱导HFL-1细胞活化成CAFs,健脾消癌方可通过调控α-SMA、PDGFRA的表达,抑制CAFs的活化,调控CAFs中的糖酵解限速酶PKM2的表达,抑制结直肠癌肺转移。

健脾消癌方联合化疗治疗晚期转移性结直肠癌的临床研究

目的:探讨健脾消癌方联合化疗治疗晚期结直肠癌的疗效及安全性。方法:将68例晚期结直肠癌患者随机分为治疗组和对照组,每组34例,治疗组采用健脾消癌方配合FOLFIRI化疗方案治疗,对照组单纯采用FOLFIRI方案化疗。结果:两组客观有效率(RR)分别为32.35%和20.59%,差异无统计学意义,疾病控制率(DCR)分别为79.41%和55.88%,差异具有统计学意义(P<0.05);患者的中位无进展生存期(PFS)分别为11.6个月和8.8个月(P<0.05),中位总生存时间(OS)分别为25.6个月和20.8个月(P<0.05);对其中的31例肝转移患者进行亚组分析,两组RR比较差异无统计学意义,DCR比较差异有统计学意义(P<0.05),但是PFS和OS差异无统计学意义;治疗组血液学不良反应及消化道不良反应的发生率明显低于对照组(P<0.05);治疗组化疗后生活质量改善情况明显优于对照组(P<0.05);与治疗前比较,两组治疗后CEA和CA199均显著下降,且治疗组下降较对照组更明显(P<0.05)。结论:健脾消癌方联合化疗治疗晚期转移性结直肠癌能提高DCR,延长晚期大肠癌的PFS和OS,并能减轻血液学及消化道不良反应、提高患者生活质量、有效降低肿瘤标志物。

健脾消癌方对结直肠癌移植模型裸鼠NLRP3炎性小体表达及免疫功能的影响

目的:探讨健脾消癌方防治结直肠癌转移可能的作用机制。方法:随机抽取10只BALB/C-nu裸鼠作为空白组,其余裸鼠采用盲肠黏膜内注射HCT116细胞方法建立人结直肠癌裸鼠移植模型,建模3d后取存活裸鼠30只,随机分为模型组、健脾消癌方高、低剂量组。健脾消癌方高、低剂量组分别予健脾消癌方41.6、10.4g·kg-1·d-1灌胃;空白组与模型组以0.9%氯化钠溶液2mL/100g灌胃,连续给药4周,每日给药1次。Western Blot检测肝转移瘤组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达量;流式细胞术检测血液NK细胞数量,CSFE/7-AAD法检测NK细胞的杀伤活性;比较各组裸鼠肝、肺、淋巴转移情况。结果:中药高、低剂量组肝、肺、淋巴结转移率均低于模型组(P<0.05),健脾消癌方高剂量组肝、肺转移率低于低剂量组(P<0.05)。与空白组比较,各组裸鼠肝转移瘤组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达均下降(P<0.05),NK细胞数量及活性均下降;与模型组比较,健脾消癌方高、低剂量组肝转移瘤组织NLRP3、Caspase-1蛋白表达均有升高(P<0.05,P<0.01),NK细胞数量及活性均有升高(P<0.05,P<0.01)。结论:NLRP3炎性小体表达下调可能参与结直肠癌病情进展,健脾消癌方可拮抗结直肠癌转移,提高结直肠癌移植模型裸鼠血液NK细胞数量及活性,其作用机制可能与升高NLRP3、Caspase-1蛋白表达有关。

健脾消癌方对人大肠癌裸鼠皮下移植瘤微血管生成的影响

目的:研究健脾消癌方对人肠癌裸鼠皮下移植瘤微血管生成的抑制作用。方法:通过在裸鼠腋下接种人肠癌HCT116细胞建立裸鼠人肠癌移植瘤模型。60只荷瘤裸鼠随机分为模型组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)组及健脾消癌方高、中、低剂量组,每组12只,各组分别给予0.9%氯化钠溶液、5-Fu(30mg/kg,1次/d)及不同浓度的健脾消癌方(高、中、低剂量)干预。给药21d后,每组随机处死6只裸鼠,摘除瘤体并眼球取血,测量瘤体重量和体积,ELISA法检测裸鼠血清中血管内皮生长因子(VEGF)的表达、免疫组化检测瘤体微血管密度(MVD);每组剩余裸鼠观察荷瘤鼠生存时间。结果:与模型组比较,药物干预组的瘤体重量均有不同程度减轻(P<0.01)、荷瘤鼠中位生存时间显著延长(P<0.01),其中5-Fu组和健脾消癌方高、中剂量组在瘤体重量、抑瘤率及延长荷瘤鼠中位生存时间方面均优于健脾消癌方低剂量组(P<0.01),且健脾消癌方高剂量组与5-Fu组的作用差异无统计学意义。同时,健脾消癌方能显著下调裸鼠血清中VEGF表达水平(P<0.01);免疫组化结果显示,健脾消癌方以浓度依赖性方式下调肿瘤组织MVD表达,与模型组比较差异显著(P<0.01)。结论:健脾消癌方能够抑制裸鼠人大肠癌移植瘤生长、延长生存期,其作用可能和降低血清VEGF表达及肿瘤MVD有关。