金匮肾气丸通过调控PI3K-AKT-mTOR及PI3K-AKT-GLUT4通路干预多囊卵巢综合征大鼠的作用机制研究

目的:基于PI3K-AKT-mTOR、PI3K-AKT-GLUT4两通路探讨金匮肾气丸对多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome, PCOS)大鼠的干预作用及机制。方法:60只雌性SD大鼠随机为正常对照组、模型对照组、达英-35+二甲双胍(0.2 mg/kg+0.23 g/kg)组和金匮肾气丸0.5、1、2 g/kg,每组10只。除正常对照组外,其余各组大鼠每天灌胃来曲唑1 mg/kg以建立PCOS模型,连续21 d。造模第16 d开始阴道涂片检测动情周期,见阴道上皮细胞持续角化者即为PCOS模型大鼠,第22 d开始灌胃给予相应药物或者CMC-Na, 1次/d,连续21 d。末次给药24 h后,腹主动脉取血,ELISA法测定血清雌二醇(Estrogen, E2)、睾酮(Testosterone, T)、促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)、促卵泡素(Follicle stimulating hormone, FSH)和促黄体生成素(Luteinizing hormone, LH)含量;取大鼠双侧卵巢,称质量,计算卵巢系数;HE染色法观察卵巢病理变化;免疫组织化学法检测卵巢组织中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)蛋白阳性表达;实时荧光定量PCR法检测Pi3k、Akt、Mtor、Glut4 mRNA表达。结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠卵巢系数明显增加,血清T、GnRH、LH含量明显升高,FSH和E2含量明显降低(P<0.05);卵巢组织中闭锁卵泡增多,囊性病变增加,卵巢组织中PI3K、p-AKT、p-mTOR、GLUT4蛋白表达及mRNA表达明显下调(P<0.05);与模型对照组比较,各给药组大鼠卵巢系数明显减小,血清T、GnRH、LH含量明显降低,FSH和E2含量明显升高(P<0.05);卵巢组织囊性病变明显减轻,卵巢组织中PI3K、p-AKT、p-mTOR、GLUT4蛋白阳性表达及mRNA表达明显上调(P<0.05)。结论:金匮肾气丸通过调节雌、雄激素分泌及PI3K-AKT-mTOR、PI3K-AKT-GLUT4两通路相关因子表达来实现其对PCOS大鼠的干预作用。

金匮肾气丸合补中益气汤加减治疗绝经后骨质疏松症的疗效及对免疫炎症因子的调节作用

目的:观察金匮肾气丸合补中益气汤加减治疗绝经后骨质疏松症(PMO)脾肾两虚证的临床疗效,对细胞免疫炎症因子的调节作用。方法:将160例患者按随机数字表分为对照组和观察组,每组80例。两组患者均给予综合西医治疗措施,对照组口服壮骨止痛胶囊,4粒/次,3次/d;观察组口服金匮肾气丸联合补中益气汤治疗,1剂/d。两组均连续治疗24周。采用双能X射线吸收检测法(DXA)测量治疗前后腰椎L2-4骨密度和定量CT(QCT)测量治疗前后腰椎骨密度;进行中医证候评分和中国人骨质疏松症生存质量简明量表(COQOL)评分;检测治疗前后雌二醇(E2),Ⅰ型原胶原氨基端前肽(PINP),血清骨钙素(OC),骨保护素(OPG),Ⅰ型胶原交联C末端肽(S-CTX),抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)和尿吡啶啉(PYD)水平;检测治疗前后CD4^(+)T细胞,CD8^(+)T细胞,白细胞介素-17(IL-17),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)水平,计算CD4^(+)T细胞中辅助性T细胞(Th)17和调节性T细胞(Treg)的比例;进行安全性评价。结果:观察组DXA测量骨密度,T和QCT测量骨密度均高于对照组(P<0.01);观察组中医证候评分和COQOL评分均低于对照组(P<0.01);观察组PINP,OC,S-CTX,TRACP和PYD/Cr水平均低于对照组,OPG高于对照组(P<0.01);观察组CD8^(+)和Treg水平高于对照组(P<0.05),Th17,Th17/Treg,CD4^(+)/CD8^(+)低于对照组(P<0.05);观察组IL-17,TNF-α,IFN-γ水平低于对照组,IL-4和E_(2)水平高于对照组(P<0.01);观察组疗效优于对照组(Z=2.103,P<0.05)。结论:采用金匮肾气丸联合补中益气汤治疗PMO脾肾两虚型患者,可提高E_(2)水平,提高骨密度,减轻临床症状,提高生活质量,能调节骨代谢指标和免疫炎症反应,有着较好的临床疗效,且安全。

金匮肾气丸醇提物HPLC特征指纹图谱的研究

目的:建立金匮肾气丸醇提物RP-HPLC指纹图谱的分析方法。方法:采用低压梯度洗脱的方法进行色谱分离,实验测定多批样品并记录指纹图谱,计算相似度。结果:共确定了16个峰为金匮肾气丸的指纹特征峰,自制样品相似度良好,与不同厂家生产的样品相似度有一定的差异。结论:该法精密度高,重复性好,可为金匮肾气丸的指纹图谱评价提供依据。

金匮肾气丸对腺嘌呤致肾间质纤维化大鼠的影响

目的：研究金匮肾气丸对腺嘌呤致大鼠肾间质纤维化的保护作用,并探讨其作用机制。方法：96只SD大鼠随机分成正常组、模型组、氯沙坦组（5 mg·kg-1）和金匮肾气丸高、中、低剂量组（2.4,1.2,0.6 g·kg-1）,采用腺嘌呤灌胃（200 mg·kg^（-1）·d^（-1））诱导肾间质纤维化大鼠模型,2 h后灌胃给予相应药物,造模连续9周;给药连续16周。采用生化法测定血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平;苏木素-伊红（HE）染色观察大鼠肾脏组织病理改变情况;马松（Masson）染色观察大鼠肾脏胶原沉积情况;以实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）测定大鼠肾脏组组转化生长因子-β1（TGF-β1）,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,钙黏蛋白（E-cadherin）,Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）,Ⅲ型胶原（Col-Ⅲ）,Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）,基质金属蛋白酶-1（MMP-1）,基质金属蛋白酶-2（MMP-2）,基质金属蛋白酶-9（MMP-9）,基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）,基质金属蛋白酶抑制剂-2（TIMP-2）mRNA的表达;以免疫组化法测定大鼠肾脏TGF-β1,α-SMA和E-cadherin的表达。结果：与正常组比较,模型组中SCr和BUN显著升高（P〈0.01）,给予金匮肾气丸干预后SCr和BUN水平降低（P〈0.05）;HE染色和Masson染色结果显示,与正常组比较,模型组肾间质损伤严重且肾间质胶原物质大量沉积,给予金匮肾气丸干预后肾间质小管损伤减轻,肾间质胶原物质沉积减少;Real-time PCR结果显示,与正常组比较,模型组TGF-β1,α-SMA,Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,Col-Ⅳ,TIMP-1,TIMP-2mRNA表达上调（P〈0.05）,模型组E-cadherin,MMP-1,MMP-2,MMP-9 mRNA表达下调（P〈0.05）,给予金匮肾气丸干预后E-cadherin,MMP-1,MMP-2,MMP-9 mRNA的表达上调（P〈0.05）,TGF-β1,α-SMA,Col-Ⅰ,Col-Ⅲ,Col-Ⅳ,TIMP-1,TIMP-2mRNA的表达明显下调（P〈0.05）;免疫组化结果显示,与正常组比较,模型组E-cadherin蛋白表达下调（P〈0.01）,TGF-β1和α-SMA蛋白表达上调,金匮肾气丸干预后E-cadherin蛋白表达上调（P〈0.05）,TGF-β1和α-SMA蛋白表达下调（P〈0.05）。结论：金匮肾气丸可有效改善肾间质纤维化并对肾脏有一定的保护作用,其改善肾间质纤维化的机制可能与降低基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1,TIMP-2）活性,TGF-β1蛋白表达,α-SMA蛋白表达,升高基质金属蛋白酶（MMP-1,MMP-2,MMP-9）活性,E-cadherin蛋白表达,从而减少胶原物质的沉积有关。

不同补益方剂对老龄小鼠生精细胞凋亡的影响

目的：探讨不同补益方剂左归丸、右归丸、六味地黄丸、金匮肾气丸、五子衍宗丸、八珍汤对老龄小鼠生精细胞凋亡的影响。方法：将80只15月龄BALB/c小鼠随机分为老年组、左归丸组、右归丸组、六味地黄丸组、金匮肾气丸组、五子衍宗丸组、八珍汤组以及阳性药物（左卡尼汀）组,每组10只,另设10只2月龄BALB/c小鼠为青年组,各给药组按中药含生药2.5 g·kg-1分别灌胃给予相应药物,左卡尼汀组肌肉注射给药45 mg·kg-1,每天1次,连续4周。于末次给药24 h后将小鼠摘眼球取血,分离血浆、血清,利用酶联免疫吸附法（ELISA）测定小鼠血中丙二醛（MDA）,一氧化氮合酶（NOS）,促红细胞生成素（EPO）,超氧化物歧化酶（SOD）以及外周血促卵泡生成激素（FSH）,促黄体生成激素（LH）,睾酮（T）的含量;采用免疫组化法检测各组小鼠睾丸组织Ki-67的表达;采用TUNEL法检测各组小鼠生精细胞凋亡情况。结果：与青年组比较,老年组小鼠MDA,NOS,EPO水平明显上升（P〈0.05）;与老年组比较,各治疗组小鼠血清MDA,NOS,EPO水平明显下降（P〈0.05）,除五子衍宗丸组和六味地黄丸组外,各治疗组小鼠血清SOD水平上升（P〈0.05）。与青年组比较,老年组小鼠血清FSH明显升高及LH,T含量明显下降（P〈0.05）;与老年组比较,五子衍宗丸组小鼠血清FSH明显下降及LH,T含量明显升高（P〈0.05）。免疫组化法检测结果显示,与青年组比较,老年组小鼠睾丸组织内Ki-67表达水平明显下降（P〈0.05）;与老年组比较,左卡尼汀组、六味地黄丸组、八珍汤组以及五子衍宗丸组小鼠睾丸组织Ki-67表达水平升高（P〈0.05）。TUNEL法检测结果显示,与青年组比较,老年组小鼠生精细胞凋亡率明显上升（P〈0.05）;与老年组比较,各治疗组小鼠生精细胞凋亡率均明显下降,以五子衍宗丸下降率最显著（P〈0.05）。结论：6个不同的补益方剂对老龄小鼠生精细胞凋亡都有一定的抑制作用,其中以五子衍宗丸效果最佳。