金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦醇对RSV的RNA聚合酶转录活性的影响

目的研究金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦醇对呼吸道合胞病毒(RSV)RNA聚合酶转录活性的作用。方法通过体外分离病毒核糖核蛋白复合体(RNP)进行体外转录,并在转录过程中应用放射性核苷酸标记,同位素检测RSV的mRNA全长转录本,从而观察金欣口服液含药血清及其有效单体白藜芦醇对RSV的RNA依赖的RNA聚合酶活性的影响。结果正常细胞组与病毒感染细胞模型组放射性核苷酸辐射强度有显著差异(P<0.01),而白藜芦醇组转录掺入的放射性核苷酸明显低于病毒对照组(P<0.01),而各含药血清组差异不显著。结论金欣口服液有效单体白藜芦醇对RSV的RNA依赖的RNA聚合酶有较好的抑制作用,其可能是金欣口服液抗RSV的作用机制之一。

金欣口服液对RSV感染细胞TLR4及TNF-α表达的影响

目的研究开肺化痰清热止咳中药金欣口服液对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的Hep-2细胞TLR4及该通路下游细胞因子TNF-α表达的影响。方法制备血行药物成分溶液,作用于RSV感染的Hep-2细胞,通过RT-qPCR、免疫荧光标记结合激光共聚焦技术及ELISA法,分别观察分析细胞TLR4mRNA、蛋白和相关细胞因子的表达水平,分析药物作用机制。结果与病毒对照组比较,金欣口服液作用于RSV感染的Hep-2细胞后,TLR4mRNA及蛋白表达显著降低,TNF-α表达显著降低,细胞病变程度减轻。结论金欣口服液含药血清可以通过下调TLR4和TNF-α表达水平减轻感染RSV后Hep-2细胞的病变程度。

金欣口服液不同化学部位对呼吸道合胞病毒感染的影响

目的观察金欣口服液不同化学部位在体内的抗呼吸道合胞病毒(RSV)作用。方法小鼠经滴鼻感染RSV建立肺炎模型,随机分为正常对照组、模型对照组、利巴韦林组、金欣口服液组、金欣口服液石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取液组及母液组,光镜下观察肺组织的炎症病变情况,计算小鼠肺指数和肺指数抑制率、脾指数、胸腺指数、死亡保护率。结果金欣口服液石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取液对RSV感染后小鼠的肺指数增高均有显著的降低作用(P<0.01),减轻感染小鼠肺组织炎症病变,同时能增加脾指数和胸腺指数(P<0.01)。金欣口服液正丁醇提取液能降低RSV感染小鼠的死亡率。结论金欣口服液石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取液对RSV具有一定的抑制作用,并且能提高RSV感染小鼠的免疫功能。正丁醇提取液对RSV感染小鼠具有一定的死亡保护作用。

金欣口服液对RSV感染RAW264.7细胞及BALB/c小鼠TNF-α表达的调控作用

目的:通过研究不同时间点金欣口服液对呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响,进一步阐明金欣口服液治疗RSV肺炎的作用机制。方法:体外实验:RSV感染体外培养的RAW264.7细胞,金欣口服液合药血清进行干预,24h后收集细胞上清,ELISA法检测各组TNF-α含量;体内实验:RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,金欣口服液不同剂量及给药方式进行干预,并于首次滴鼻后24、72、144h取各组小鼠支气管肺泡灌洗液,ELISA法检测TNF-α表达及金欣口服液的干预效果。结果:RSV感染RAW264.7细胞及BALB/c小鼠后24h,TNF-α表达明显升高(P<0.01),而金欣口服液组较RSV感染组TNF-α表达明显下调(P<0.01);72h后,RSV感染小鼠体内TNF-α表达虽较正常组高(P<0.05),但较24h组明显下降(P<0.01),而金欣口服液等效剂量预防及治疗组TNF-α表达较RSV感染组均明显升高(P<0.01);144h后,RSV感染小鼠体内TNF-α表达较正常组无差异(P>0.05),而金欣口服液高剂量及等效剂量治疗组TNF-α表达均较RSV感染组明显升高(P<0.05)。结论:金欣口服液能显著下调RSV感染初期TNF-α的高表达,且随着感染时间的延长,可适当上调TNF-α的表达,表明金欣口服液对RSV感染后体内TNF-α的表达具有一定的双向调节趋势,这可能是其治疗RSV肺炎的作用机制之一。

金欣口服液对RSV感染BALB/c小鼠肺组织TLR4及TAK1表达的调控作用

目的通过观察金欣口服液(炙麻黄、苦杏仁、生石膏、黄芩等)对呼吸道合胞病毒(RSV)感染肺组织TOLL样受体4(TLR4)及转化生长因子β活化激酶(TAK1)表达的调控趋势,探讨金欣口服液抗病毒机制以及TLR4信号通路途径。方法 RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,金欣口服液给药进行干预,并于首次滴鼻后24 h取各组小鼠肺组织,Western Blot法检测小鼠肺组织TLR4、TAK1蛋白表达。结果 RSV感染BALB/c小鼠后24h,TLR4﹑TAK1蛋白表达明显升高(P<0.01),而金欣口服液组较RSV感染组TLR4﹑TAK1表达明显下调(P<0.01);金欣组蛋白表达量最低,与利巴韦林组相比,P<0.01,利巴韦林组与RSV感染组相比P<0.01。结论金欣口服液能抑制TLR4信号转导通路中TLR4/TAK1蛋白的表达,TLR4的蛋白表达与TAK1的蛋白表达呈正相关,金欣口服液抗RSV作用机制中的TLR4信号通路途径可能是通过TAK1实现的。

基于GC-MS代谢组学的金欣口服液治疗RSV感染的体外研究

目的:通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术分析Hep-2细胞内源性代谢产物的相对含量变化,阐明金欣口服液体外抗RSV感染的作用机制。方法:RSV感染接种于6孔板上的Hep-2细胞,予金欣口服液治疗,24 h后予以液氮淬灭细胞,先后加入水-甲醇-氯仿(v:v:v,1:8.1:0.9)以便取少量细胞悬浮液行蛋白定量和萃取细胞代谢物,运用GC-MS检测细胞样品内源性代谢物及其相对含量的变化,并分析其可能参与的代谢通路。结果:RSV感染的细胞样本中共测得29种内源性代谢产物,其中谷氨酰胺、γ-氨基丁酸、甘氨酸、柠檬酸、乳酸等为差异代谢产物(P<0.05),主要与谷氨酰胺、甘氨酸、丙酮酸代谢通路有关。结论:金欣口服液体外治疗RSV感染的机制可能与调节RSV感染后引起的代谢紊乱有关。

金欣口服液对呼吸道合胞病毒肺炎大鼠模型TNF-α、分泌型IgA的影响

目的:探讨中药复方金欣口服液对呼吸道合胞病毒肺炎模型幼年大鼠血清中TNF-α、支气管肺泡及小肠灌洗液中SIgA的影响。方法:将56只幼年大鼠随机分为正常组,模型组,金欣高、中、低剂量组及预先给药组,西药利巴韦林组,共7组。RSV滴鼻3天后灌胃给药,连续用药7天后处死。ELISA法测定各组大鼠血清中TNF-α、支气管肺泡及小肠灌洗液中SIgA的水平。结果:模型各组血清TNF-a及黏膜SIgA的含量表达水平均高于正常组(P<0.01)。与模型组相比,金欣高剂量、中剂量组血清TNF-a明显增高(均P<0.01),差异具有统计学意义,且金欣高剂量组与利巴韦林组比较有显著性差异(P<0.01);金欣预先给药组、高剂量组的支气管肺泡及小肠灌洗液和中剂量组支气管肺泡灌洗液中SIgA的表达均增高,差异具有统计学意义。其中预先给药组与高剂量组的支气管肺泡及高剂量组的小肠灌洗液和中剂量组支气管肺泡灌洗液与利巴韦林组比较有显著性差异(分别为P<0.01、P<0.05)。结论:金欣口服液可增加RSV肺炎模型幼年大鼠TNF-α、SIgA的分泌,并且存在一定的量效关系,是治疗RSV感染的有效方剂。

金欣口服液对感染RSV大鼠血清IL-6、IL-8的影响

目的:观察金欣口服液对感染呼吸道合胞病毒(RSV)大鼠血清中IL-6、IL-8的影响。方法:将56只SD大鼠随机分为7组,分别为正常组,模型组,金欣高、中、低剂量治疗组,预先给药组,利巴韦林治疗组。用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组SD大鼠血清中IL-6、IL-8的水平。结果:大鼠感染RSV后血清中IL-6、IL-8水平均高于正常组(P<0.05),金欣治疗组及利巴韦林组干预后IL-6、IL-8水平显著降低(P<0.01);与利巴韦林组相比,金欣高剂量组、预先给药组的IL-6的水平明显降低(P<0.01);预先给药组中,血清IL-6的水平低于中、低剂量组(P<0.01),而IL-8水平比高、中、低剂量组均显著降低(P<0.01)。结论:金欣口服液能降低两者的水平,且以预先给药方式更为有效,推测可以预防和治疗感染RSV的大鼠。

金欣口服液不同极性部位的抗炎、祛痰和解热实验研究

目的研究金欣口服液不同极性部位的抗炎、祛痰和解热作用,筛选其治疗病毒性肺炎的药效部位。方法分别采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀法、大鼠毛细管法排痰量和干酵母致热大鼠模型考察金欣口服液及其不同极性部位(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水)的抗炎、祛痰和解热作用。结果与空白对照组比较,乙酸乙酯部位(P<0.05)和正丁醇部位(P<0.01)均有明显抑制二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的作用;乙酸乙酯部位和正丁醇部位(P<0.01)均能显著增加大鼠毛细管排痰量;正丁醇部位对干酵母所致发热大鼠给药后1、2、3、4、5h均有显著降热作用(P<0.05或P<0.01)。结论乙酸乙酯部位和正丁醇部位是金欣口服液治疗病毒性肺炎的主要药效部位。

金欣口服液对RSV感染BALB/c小鼠RIG-I信号传导通路的影响

目的:研究金欣口服液对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的BALB/c小鼠肺组织中RIG-I信号传导通路的影响,探讨其可能的抗病毒机制。方法:RSV滴鼻感染BALB/c小鼠,不同剂量金欣口服液灌胃给药进行干预,于首次滴鼻后24 h、72 h、144 h取各组小鼠肺组织,Real time RT-PCR分别检测RSV-M、RIG-I、IPS-I和IFN-β在mRNA水平的表达情况,Western Blot检测RIG-I和IPS-I在蛋白水平上的表达情况。结果:RSV感染24 h和72 h后,其肺组织中RIG-I、IPS-I和IFN-β的表达均较正常组显著升高,金欣口服液不同剂量组RIG-I、IPS-I和IFN-β表达较RSV组明显下调;144 h后,RIG-I、IPS-I和IFN-β表达量显著下调,金欣口服液不同剂量组能上调RIG-I、IPS-I和IFN-β的低表达。结论:RSV能诱导RIG-1信号传导通路的激活从而促进IFN-β的表达,而金欣口服液能通过调控RIG-1信号通路从而调节IFN-β的表达。

金欣口服液抗呼吸道病毒实验研究

目的:观察金欣口服液对小鼠流感病毒和副流感病毒性肺炎模型的影响及体外对腺病毒致细胞病变作用的影响。方法:小鼠经滴鼻感染流感病毒和仙台病毒造成肺炎模型,计算小鼠死亡保护率、肺指数和肺指数抑制率;体外抗病毒实验采用MTT法测病变抑制率。结果:金欣口服液对流感病毒和仙台病毒致小鼠肺部炎症有明显抑制作用,可明确降低流感病毒和仙台病毒感染后小鼠的死亡率;体外实验表明,金欣口服液对腺病毒引起的细胞病变有明显抑制作用。结论:金欣口服液对流感病毒、仙台病毒、腺病毒均有抑制作用。

基于高分辨率质谱的金欣口服液治疗小鼠RSV感染的血清脂质组学研究

目的基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS高分辨率质谱,观察RSV诱发的肺炎模型小鼠的血清中脂质代谢的变化,分析金欣口服液对RSV肺炎小鼠中脂质代谢紊乱的调节作用,探讨金欣口服液治疗RSV诱发的病毒性肺炎的潜在机制。方法用RSV诱导小鼠病毒性肺炎,灌胃金欣口服液予以治疗,分别采集对照组、模型组、金欣口服液组小鼠的血清样本,提取脂质成分,采用LC-MS分析,采用主成分分析法(PCA)、聚类分析法(CA)等多元统计方法,对小鼠血清脂质代谢轮廓进行分析,同时进行Kruskal–Wallis test以及fold change法进行统计,寻找差异性脂质。结果 RSV感染导致小鼠肺部炎性细胞浸润及不同程度的肺炎,血清中多种脂质代谢物代谢紊乱,具体表现多数PC、PE出现明显上调,金欣口服液均能改善小鼠肺炎症状且显著恢复血清中异常紊乱的脂质。结论 RSV感染可导致小鼠血清中脂质代谢紊乱,而金欣口服液可一定程度恢复RSV模型中代谢紊乱的脂质,提示金欣口服液可通过调节脂质改善RSV诱发的肺炎。

金欣口服液含药血清抗呼吸道合胞病毒间接抑制作用实验研究

目的:研究金欣口服液对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的人喉癌上皮细胞(Hep-2)细胞的间接抑制作用。方法:含药血清先作用细胞一段时间再感染RSV。用MTT法测病变抑制率及测上清滴度观察金欣口服液含药血清对RSV的间接抑制作用。结果:MTT法测定病毒抑制率均大于50%,含药血清组上清滴度与空白血清组和病毒对照组比较有显著差异,滴度低于后两组。结论:金欣口服液含药血清可能有抑制RSV胞膜上的吸附蛋白与细胞表面受体结合的作用。

基于网络药理学探讨金欣口服液治疗新型冠状病毒肺炎的潜在作用机制

目的采用网络药理学方法探究金欣口服液治疗新型冠状病毒肺炎的可能性和潜在作用靶点。方法利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选金欣口服液的物质组成分,以口服生物吸收度和成药相似性为限制条件筛选类药性成分及其作用靶点。以规范化的MeSH主题词搜索疾病相关的靶点基因,并对靶点进行蛋白交互作用分析。进一步利用DAVID数据库进行基因本体分析,以类药性成分→基因靶点→作用通路的交互网络分析金欣口服液治疗新型冠状病毒肺炎的可能效应成分和潜在作用靶点。结果金欣口服液中筛选得到129种类药性成分,以苯丙素和脂类成分为主。筛选到类药成分作用于病毒性肺炎相关的靶点基因75个,基因本体分析和交互网络分析结果显示其黄酮类成分和脂质类成分具有抗病毒免疫和抗炎作用。结论金欣口服液具有潜在的抗新型冠状病毒肺炎的作用。

金欣口服液调控心磷脂代谢抗呼吸道合胞病毒感染的机制研究

目的研究金欣口服液及其主要成分黄芩苷对呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)诱导心磷脂代谢异常的影响及可能的作用机制。方法将BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组和金欣口服液给药组。前3 d以RSV混悬液滴鼻建立RSV感染模型,从第3天下午开始,金欣口服液组予金欣口服液(27.6 g·kg^(-1)·d^(-1))连续灌胃给药3 d。体外实验采用RSV感染Raw264.7细胞的方式建立病毒感染模型,黄芩苷组给予黄芩苷(100 mg·kg^(-1)·d^(-1))干预。采用色谱质谱联用的方式分别检测小鼠肺组织及Raw264.7细胞心磷脂代谢谱的变化。qPCR法检测RSV表面蛋白RSV-F、RSV-G,炎症因子IL-6、IL-1β、Tnf-α,心磷脂代谢酶Tafazzin(TAZ)、心磷脂合成酶1(Crls1)、心磷脂转运酶(PLSCR3)以及自噬受体蛋白SQSTM1/P62(p62)的转录水平。Western blot法检测p62蛋白表达水平,分子对接检测p62与CL14∶0-16∶1-16∶1-18∶2的结合能力。结果RSV感染小鼠及细胞模型中IL-6、IL-1β、Tnf-αmRNA表达增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001),金欣口服液及黄芩苷可以起到一定的回调作用;RSV感染后心磷脂代谢谱发生了变化,金欣口服液及黄芩苷可起到一定的调节作用;模型组小鼠肺组织中的Crls1、TAZ mRNA表达显著上调(P<0.01),给予金欣口服液之后Crls1、TAZ mRNA表达明显降低下调(P<0.01),细胞模型组中Crls1 mRNA表达明显增加(P<0.001),黄芩苷干预后Crls1 mRNA表达显著降低(P<0.0001);RSV感染小鼠肺组织p62蛋白表达明显下降(P<0.001),给予金欣口服液之后p62蛋白表达显著增加(P<0.01)。Raw264.7细胞模型组p62蛋白表达明显增加(P<0.05),给予黄芩苷后p62蛋白水平进一步显著升高(P<0.0001);分子对接结果表明心磷脂CL14∶0-16∶1-16∶1-18∶2可与p62的UBA结构发生阈结合。结论金欣口服液以及黄芩苷可改善RSV诱导的心磷脂代谢紊乱,调节线粒体功能,进而发挥了抗RSV感染作用。

金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒感染细胞早期凋亡的影响

目的:探讨金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染细胞早期不同时点凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响。方法:采用细胞培养、血清药理学、流式细胞术等实验技术检测金欣口服液含药血清抗RSV,影响细胞早期凋亡作用途径的影响。结果:RSV感染人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞12、24h后凋亡率均低于细胞对照组(P<0.05),Bcl-2/Bax比例逐步上调,金欣口服液作用后,凋亡率明显高于病毒组(P<0.05),Bcl-2/Bax比值明显低于病毒组(P<0.05)。结论:金欣口服液在RSV感染早期,可能通过调控凋亡相关基因拮抗其抑制细胞凋亡的作用,从而影响进入细胞内的病毒复制增殖的过程,阻止病毒的扩散。

金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒感染RAW264.7细胞Toll样受体3表达的调控作用

目的:通过研究金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)活化诱导的Toll样受体3(TLR3)的干预作用,探讨其治疗RSV肺炎可能的免疫学机制。方法:RSV感染体外培养的RAW264.7细胞,采用金欣口服液含药血清进行干预,并设利巴韦林阳性对照,24h后收集细胞,Real time RT-PCR法测定TLR3 mRNA的表达变化;激光共聚焦显微镜观察免疫荧光细胞化学染色法处理的各组细胞TLR3表达水平;ELISA法检测各组细胞培养上清中白细胞介素-6(IL-6)含量,在核酸及蛋白水平探讨金欣口服液含药血清抗RSV感染的作用机制。结果:RSV感染RAW264.7细胞后24h,细胞中TLR3 mRNA和蛋白表达水平以及细胞培养上清中IL-6表达明显升高(P<0.01),而金欣组TLR3及IL-6表达均显著低于RSV感染组(P<0.01,P<0.05),且效果优于利巴韦林组(P<0.01,P<0.05)。结论:金欣口服液含药血清能下调RSV活化诱导的TLR3及其下游炎症因子IL-6的高表达,推测其为金欣口服液抗RSV感染的机制之一。

金欣口服液对呼吸道合胞病毒感染大鼠Ⅰ型干扰素表达的影响

目的:探讨金欣口服液对呼吸道合胞病毒(RSV)感染大鼠Ⅰ型干扰素(IFN)-α/β表达的影响。方法:采用细胞培养、动物实验、ELISA(酶标记免疫吸附测定)法检测大鼠体内IFN-I表达量的变化。结果:金欣口服液预防组和中剂量组IFN-α表达量高于模型组(P<0.05);金欣口服液高、中剂量组IFN-β表达量高于模型组(P<0.05)。结论:金欣口服液抗RSV的机制可能与其通过上调RSV感染宿主体内Ⅰ型干扰素的表达,从而发挥Ⅰ型干扰素的抗病毒效应有关。

UPLC法同时测定金欣口服液中8种指标成分

目的建立UPLC法同时测定金欣口服液中芥子碱硫氰酸盐、虎杖苷、野黄芩苷、白藜芦醇、黄芩苷、大黄素-8-O-β-葡萄糖苷、黄芩素、汉黄芩素8种指标成分的量。方法采用UPLC法,Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相,体积流量0.4 mL/min,梯度洗脱,检测波长280 nm,柱温35℃;分别对线性关系、精密度、重复性、稳定性及加样回收率进行考察。结果被测定的8种指标成分分别在选定的范围内线性关系良好,平均加样回收率99%～102%,RSD均小于3.1%。结论本方法操作简便,测定结果准确可靠,可用于金欣口服液的质量控制。

金欣口服液血中移行成分体外抗呼吸道合胞病毒的研究

目的:通过研究金欣口服液血中移行成分的体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)作用,明确金欣口服液作用的物质基础。方法:采用细胞培养技术,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性,以利巴韦林为阳性对照,观察金欣口服液血中移行成分槲皮素、虎杖苷、黄芩素、汉黄芩素、异鼠李素、大黄素甲醚在人喉癌上皮细胞(Hep-2)中对RSV的抑制作用,以治疗指数(TI)为评价指标。结果:在Hep-2细胞中槲皮素、虎杖苷、黄芩素、异鼠李素、大黄素甲醚对RSV具有直接灭活作用,TI分别为12.78、38.07、28.93、9.43、1.58,槲皮素、异鼠李素对RSV感染具有一定的治疗作用,TI分别为12.00、4.25,汉黄芩素对RSV感染有预防作用,TI为1.57。结论:槲皮素、虎杖苷、黄芩素、汉黄芩素、异鼠李素、大黄素甲醚是金欣口服液抗呼吸道合胞病毒的物质基础。