大白猪CDO 1基因克隆、生物信息学分析及组织表达定位

【目的】克隆大白猪半胱氨酸双加氧酶1(cysteine dioxygenase type 1,CDO1)基因并进行生物信息学分析,检测CDO 1基因在大白猪不同组织中的表达情况,并定位CDO1在乳腺中的位置,为进一步探究CDO 1基因在乳腺发育过程中的调控作用提供依据。【方法】通过PCR扩增大白猪CDO 1基因CDS全长序列,将CDO 1基因序列与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取单个阳性菌扩增培养,菌液通过PCR鉴定后测序,对测序结果进行不同物种间序列相似性比对及系统进化树构建;利用在线预测软件对CDO1蛋白进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测CDO 1基因在大白猪不同组织中的表达水平;利用免疫组化方法检测CDO1蛋白在母猪乳腺中的定位。【结果】大白猪CDO 1基因CDS区序列全长603 bp,编码200个氨基酸,家猪与大白猪CDO 1基因核苷酸序列相似性最高。系统进化树结果显示,大白猪与家猪先聚为一类,且与猕猴亲缘关系较近。CDO1蛋白的分子质量为23.018 ku,等电点为5.98,不稳定系数为33.58(<40),为稳定亲水性蛋白,定位在胞浆内,存在糖基化和磷酸化位点,CDO1蛋白二级结构和三级结构模型预测结果一致。组织表达分析结果显示,CDO 1基因在大白猪肝脏中表达量最高,显著高于其他组织(P<0.05),在乳腺、背最长肌和心脏中表达次之,显著高于除肝脏外的其余组织(P<0.05),在十二指肠中表达量最低。免疫组化结果显示,CDO1定位在母猪乳腺终端芽(TEB)体细胞、上皮细胞和脂肪细胞中。【结论】大白猪CDO 1基因CDS区全长603 bp,编码200个氨基酸,在心脏、肝脏、乳腺中高表达;CDO1蛋白为稳定亲水性蛋白,在母猪乳腺TEB体细胞、上皮细胞和脂肪细胞中富集。研究结果为进一步探究CDO1蛋白调控母猪乳腺发育和影响母猪泌乳功能提供参考。

猪1、3号染色体微卫星位点多态性及遗传连锁图谱的构建

利用 3头英系大白猪和 7头梅山猪为父母本建立了F2 参考家系。F1 公猪 5头 ,母猪 2 3头 ,随机交配产生 147个F2 个体。根据美国肉畜研究中心 (USDA MARC)公布的猪遗传连锁图谱 ,在 1号和 3号染色体上等间隔 (2 0cM)选择 8个和 9个微卫星标记 ,对参考家系全部的F0 、F1 和F2 个体进行扩增 ,获得各标记位点基因型。研究结果表明 ,等位基因数介于 2到 5之间 ,平均每位点 3.35个等位基因 ;部分等位基因片段长度超过USDA MARC所报道的结果。标记位点杂合度为 0 .385 3～ 0 .70 97,平均 0 .5 795。有信息的减数分裂数为 35～ 30 5 ,平均 2 40。利用此参考家系和CRI MAP软件包构建的 1号和 3号染色体图谱分别长 182 .3cM和 180 .2cM。 1号染色体的母畜图谱短于公畜图谱 ,而 3号染色体正好相反。与USDA MARC报道相比较 ,微卫星排列顺序与报道相同 ,但 1号染色体长 44 .8cM ,3号染色体长 6 3.3cM。此连锁图的构建为以后的数量性状基因位点 (quantitativetraitloci,QTLs)定位奠定了基础。

“军牧1号”猪HSP70基因的克隆及序列分析

从"军牧1号"猪淋巴细胞中提取总RNA进行RT-PCR,将获得的HSP70cDNA克隆进pMD18-T载体,并转化至受体菌DH5α中,对阳性重组子进行DNA序列分析,结果构建的克隆质粒中含有编码HSP70的完整阅读框,它由1926个核苷酸组成,编码641个氨基酸,HSP70多肽相对分子质量为70143,C末端有高度保守的EEVD序列。与其他哺乳动物HSP70基因的同源性在81%～99%。氨基酸序列的同源性在81%～98%。与其他猪种比较,"军牧1号"猪HSP70编码基因有4个核苷酸发生替换,推定的翻译序列有2个氨基酸不同。系统进化树分析表明,"军牧1号"白猪与其他猪种的亲缘关系最近。证实了HSP70基因的高度保守性,并为HSP70的进一步研究和应用奠定了基础。

“军牧1号”断乳仔猪血液生理生化指标正常参考值

选用55日龄“军牧1号”断乳仔猪30头,测定了18项血液生理指标和10项血液生化指标。结果,“军牧1号”断乳仔猪与后备猪比较,有多项血液生理生化指标差异显著(<0.01),与其他同龄杂交品种猪比较,绝大多数指标基本一致。这些指标不仅能反映断乳仔猪的健康状况和生长发育规律,而且也是兽医临床诊断和防治的重要依据。

军牧1号白猪、杜洛克猪和藏猪的H-FABP和LPIN1基因多态性分布

为探索H-FABP和LPIN1基因在不同猪种中的多态性分布情况,应用PCR-RFLP技术检测了61头军牧1号白猪、51头杜洛克猪和51头藏猪H-FABP和LPIN1基因的多态性分布。结果发现,军牧1号白猪、杜洛克猪和藏猪在H-FABP基因的HinfⅠ多态性位点上均表现为单一的HH型,而HeaⅢ多态性位点上均表现出多态性,等位基因D的基因频率分别为0.1475、0.2255和0.7647,MspⅠ多态位点上,军牧1号白猪表现为单一的aa型,杜洛克猪和藏猪则表现为多态性,等位基因A的基因频率分别为0.6078和0.4609。在LPIN1基因的Eco88Ⅰ多态性位点上,杜洛克猪表现为单一的AA型,军牧1号白猪和藏猪表现为多态性,等位基因A的基因频率分别为0.4262和0.2059;在Bsh1236Ⅰ多态性位点上,杜洛克猪表现为单一的TT型,军牧1号白猪和藏猪则表现为多态性,等位基因T的基因频率分别为0.7459和0.2059。

山东省地方畜禽品种资源的保护与利用研究

山东省地方畜禽品种资源丰富。有地方畜禽品种32个,已对烟台黑猪、莱芜黑猪等5个猪种、鲁西黄牛、德州驴、小尾寒羊、洼地绵羊、黑耳兔等19个畜种资源按照标准进行了主产地、分布区域、群体规模的描述。采集耳组织、血细胞样本800余个,并对这些样本进行了DNA提取和基因组学的分析,初步建立了山东地方家畜遗传资源库。利用地方良种历经10余年已经培育出了鲁烟白猪新品种和鲁农Ⅰ号猪配套系。

军牧1号白猪肉质主效基因的多态性检测分析

猪的肉质属于数量性状,受多个主效基因和候选基因的控制。为检测军牧1号白猪肉质主效基因多态性,本试验采用RFLP技术检测了400头军牧1号白猪氟烷基因(RYR1)、心脏脂肪酸结合蛋白基因(H-FABP)和酸肉基因(RN)3个重要肉质基因的多态性。群体遗传结构分析表明,军牧1号白猪群体中RYR1基因的N基因频率为0.908 3,n基因频率为0.091 7;心脏脂肪酸结合蛋白基因的5′区的HinfⅠ位点的H基因频率为0.688 8,h基因频率为0.311 2;H-FABP基因内含子-2HaeⅢ位点D基因频率为0.478 8,d基因频率为0.521 2;H-FABP基因内含子-2MSPⅠ位点不存在多态性;RN基因也不存在多态性。

军牧1号白猪6号染色体抗病基因FUT1和RYR1的合并选择

FUT1和RYR1是猪6q11～12区段的抗病侯选基因,为探讨军牧1号白猪群体中2基因的关联度,随机选取177头军牧1号白猪,采用PCR-RFLP法检测2对等位基因频率和基因型频率、计算连锁不平衡参数。结果表明,军牧1号白猪群体中优势基因FUT1A的频率为0.395,RYR1T的频率为0.765,两者的连锁不平衡参数LD=0.010 7和相关系数r=0.093 6均接近于零,可判定两者不存在连锁关系。研究结果支持在军牧1号白猪群体中同时进行抗病基因FUT1和RYR1的合并选择。

军牧1号公猪睾丸组织不同发育时期IGF-I基因表达量研究

胰岛素样生长因子Ⅰ是一种具有促进动物生长发育和繁殖的的肽类物质。动物要达到正常的性成熟和生殖能力则需要适当的IGF-Ⅰ水平。睾丸是雄性动物的重要生殖器官,为了探讨IGF-Ⅰ基因对于雄性动物睾丸组织发育的影响,本实验采用Real Time RT-PCR方法研究了IGF-Ⅰ基因在军牧1号白猪不同发育阶段睾丸组织的表达规律。结果表明:IGF-Ⅰ在不同发育阶段的睾丸组织中均表达,但是各个不同发育时期的表达量差异显著,六月龄时(性成熟阶段)表达量最大。本研究为深入探讨IGF-Ⅰ基因调控动物繁殖机能以及在生产中如何提高家猪的繁殖力奠定了分子生物学基础.

荧光定量分析猪睾丸组织中miR-34b的表达规律

运用荧光定量分析方法检测军牧1号白猪不同发育阶段睾丸组织miRNA-34b的表达量差异,结果:miRNA-34b在3月龄前的表达量都非常低,从5月龄开始表达量呈明显上升,7月龄达到峰值后开始明显下降。在猪的发育过程中,miRNA-34b的表达趋势曲线呈先增后降。结果表明miRNA-34b可能与猪雄性生殖发育相关。

FSP27基因对猪前体脂肪细胞增殖、分化和凋亡的影响

为研究FSP27基因对猪前体脂肪细胞增殖、分化和凋亡的影响,在军牧一号白猪原代前体脂肪细胞中转染siRNA-717沉默FSP27。猪前体脂肪细胞分化效果使用油红O染色试验检测,猪前体脂肪细胞增殖、分化、凋亡相关基因的表达使用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹等技术检测。结果表明:猪脂肪细胞中转染siRNA-FSP27后,PCNA,cyclin D2和cyclin E2的mRNA表达水平显著升高;aP2、C/EBPα、PPARγ的mRNA表达水平显著降低;油红O检测结果显示脂滴显著降低;Bax和p53的相对mRNA水平显著降低,Bcl2显著升高。表明FSP27在体外培养的猪脂肪细胞中抑制脂肪细胞增殖,促进脂肪细胞分化和凋亡。