稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料,实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达,延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中,通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术,成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统,建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示,hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快,性状较稳定,表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系,为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。

橡胶树热垦525胚性悬浮细胞系的建立及其胚性能力的维持

易碎胚性愈伤组织和胚性悬浮细胞系都是基因工程和细胞工程的理想受体材料。然而橡胶树(Hevea brasil-iensis)易碎胚性愈伤组织诱导频率低、耗时长,且其胚性能力通常随继代次数的增加而下降甚至完全丧失,限制了相关研究的持续开展。因此,快速获得易碎胚性愈伤组织,建立具有高效体胚发生能力的胚性悬浮细胞系,并尽可能较长时间维持其胚性能力是当前橡胶树基因工程和细胞工程研究的重要内容。本研究以橡胶树热垦525未成熟花药为外植体进行愈伤组织的诱导和胚性悬浮细胞系的建立,分析比较固液2种长期继代方式对维持其胚性能力的影响。结果表明:花药外植体在愈伤诱导培养基中获得的黄色致密初代愈伤组织体胚发生能力低,分散性差,不适合进行悬浮培养。将初代愈伤组织转移至胚性愈伤组织诱导培养基中培养70~80 d后,可观察到有胚性结构的形成和早期体细胞胚发生,同时周围长出鲜黄色小颗粒状易碎胚性愈伤组织。通过常规方法建立的Ⅰ型胚性悬浮细胞系具备胚性细胞的典型特征,体胚发生能力显著高于胚性愈伤组织,但在体胚发生过程中容易重新愈伤化;而通过筛选特定形态的胚性愈伤组织低密度启动悬浮培养建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系,在显微镜下可观察到细胞处在有序的胚性结构中,其体胚发生频率可达100%。在含2 mg/L2,4-D的液体培养中持续继代2 a后细胞明显老化且增殖缓慢,体胚发生能力几近丧失;而在去除2,4-D并添加低浓度脱落酸(0.1 mg/L)和水解酪蛋白(0.5 g/L)的固体培养基上持续继代2 a后,体胚发生能力仍能维持在较高水平。所建立的Ⅱ型胚性悬浮细胞系可为橡胶树遗传转化及原生质体培养等相关研究长期提供优质充足且状态相对稳定的材料来源。

神经胶质细胞系衍生神经营养因子和雄激素受体在手术诱导隐睾小鼠睾丸管周细胞中的表达

【目的】探讨神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)和雄激素受体(AR)在隐睾症小鼠睾丸管周细胞中的表达水平及对隐睾症导致生精功能障碍的理论意义。【方法】30只5周龄雄性ICR小鼠采用随机数字表法随机分配至6组中,随机抽取3组15只小鼠进行手术诱导隐睾,其余3组为作为对照组进行假手术处理。分别于4 d、7 d、14 d后取各组睾丸组织,然后测量睾丸体积、观察睾丸组织病理,提取各组睾丸管周细胞后利用免疫荧光、Re⁃al-Time PCR和蛋白质印记法检测AR和GDNF的mRNA和蛋白的表达。【结果】对照组4 d、7 d、14 d小鼠的睾丸体积分别为(125.58±19.22)mm^(3)、(123.45±20.12)mm^(3)、(140.09±13.62)mm^(3);睾丸各级生精细胞排列整齐、层次清楚,可见较多精子细胞,生精小管周围管周细胞形态规则,呈梭形围绕小管周围,细胞厚度均一;ARmRNA的表达量分别为1.00±0.05、1.06±0.07、1.19±0.13GDNFmRNA的表达量分别为1.00±0.04、1.09±0.05、1.10±0.07;AR蛋白的表达量分别为1.01±0.01、0.79±0.02、1.01±0.04;GDNF蛋白的浓度分别为(18.68±0.43)pg/mL、(14.39±0.36)pg/mL、(16.88±0.37)pg/mL。隐睾组4 d、7 d、14 d小鼠的睾丸体积分别为(115.64±3.91)mm^(3)、(69.51±14.97)mm^(3)、(44.86±5.56)mm^(3);睾丸各级生精细胞排列紊乱、层次不清、结构破坏,曲细精管周围管周细胞萎缩、弯曲断裂;ARmRNA的表达量分别为0.76±0.06、0.53±0.04、0.29±0.02;GDNFmRNA的表达量分别为0.72±0.05、0.42±0.02、0.30±0.03;AR蛋白的表达量分别为0.54±0.02、0.98±0.04、0.31±0.01;GDNF蛋白的浓度分别为(8.50±0.34)pg/mL、(17.44±0.32)pg/mL、(6.83±0.34)pg/mL。上述指标与对照组相比,除了4 d的睾丸体积差异无统计学意义(P>0.05),其他均有统计学差异(P<0.05)。对照组中3个时间点的睾丸体积、AR和GDNF的mRNA、蛋白表达量的差异无统计学意义(P>0.05),隐睾组3个时间点的睾丸体积、AR和GDNF的mRNA、蛋白表达量呈逐渐下降趋势且各组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。【结论】在手术诱导隐睾小鼠中,睾丸管周细胞的AR和GDNF的表达水平随着诱导时间的延长呈现显著下降。AR和GDNF在隐睾症介导睾丸管周细胞功能的损伤中有重要作用。本研究为阐明隐睾症导致生精功能障碍的机制研究提供理论基础。

稳定表达细胞色素P4502B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系的建立及鉴定

目的构建稳定表达细胞色素P4502B6(CYP2B6)的Flp-In^(TM)CHO细胞系。方法将Flp-In^(TM)CHO细胞分为Flp-In^(TM)CHO组、Flp-In^(TM)CHO空载体组及Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组,通过Lipofectamine2000转染试剂,分别将pcDNA5/FRT空质粒和pcDNA5/FRT-CYP2B6重组质粒转染至Flp-In^(TM)CHO空载体组细胞和Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)及荧光素酶实验检测转染细胞中CYP2B6 mRNA水平、蛋白表达水平及活性,用四氮唑盐(MTS)测定转染CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞对环磷酰胺的毒性敏感性。结果与Flp-In^(TM)CHO组和Flp-In^(TM)CHO空载体组相比,Flp-In^(TM)CHO-CYP2B6组细胞中CYP2B6的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01)、酶活性显著增加(P<0.001),对环磷酰胺的毒性敏感度显著增加(P<0.001)。结论成功构建稳定表达CYP2B6的Flp-In^(TM)CHO细胞系,为研究药物代谢和筛选毒性药物提供工具。

硫氢化钠增加高糖高脂条件下小鼠心房肌细胞系HL-1谷胱甘肽合成

目的研究硫氢化钠(NaHS)是否通过调节谷胱甘肽(GSH)的合成,降低活性氧自由基(ROS)产生,改善小鼠2型糖尿病心肌病(DCM)。方法将小鼠心房肌细胞系HL-1分为对照组、高葡萄糖(HG:40 mmol/L)和棕榈酸(Pal:500μmol/L)处理组;以及硫氢化钠(NaHS,100μmol/L)、DL-炔丙基甘氨酸[PPG,胱硫醚γ裂解酶(CSE)抑制剂,1 mmol/L]和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,ROS抑制剂,5 mmol/L)处理72 h组。Western blot检测CSE和谷胱甘肽合成酶(GSS)的表达;二氢乙锭(DHE)和二氯氟甲烷(DCFH)检测ROS含量;免疫共沉淀检测核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)泛素化水平及Nrf2与肌肉特异性环指蛋白1(Murf1)的相互作用。结果与对照组比高糖高脂处理HL-1细胞后CSE、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基C(GCLC)、谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基M(GCLM)、谷胱甘肽合成酶(GSS)的表达水平下降,而NaHS能恢复其表达。高糖高脂组ROS含量高于NaHS组。与NaSH组比高糖高脂条件下Murf1与Nrf2的相互作用增加,Nrf2泛素化水平明显增加。结论硫氢化钠减轻Nrf2的泛素化,增加GSH合成关键酶的表达。

稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定

为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

胶质细胞系源性神经营养因子/胶质细胞系源性神经营养因子受体信号通路在乳鼠先天性巨结肠相关性小肠结肠炎中的作用实验研究

目的:探讨胶质细胞系源性神经营养因子/胶质细胞系源性神经营养因子受体(GDNF/GFRα1)通路在乳鼠先天性巨结肠(HD)相关性小肠结肠炎(HAEC)中的作用研究。方法:21日龄内皮素受体(Ednrb)基因敲除乳鼠为HD模型组(实验组),同日龄野生型乳鼠为对照组,8只/组。取结肠组织,按照形态将实验组乳鼠结肠组织分为狭窄段、扩张段,对照组乳鼠结肠组织分为远段、近段。采用苏木精-伊红(HE)染色法评判两组肠管炎症程度;酶联免疫吸附法(ELISA)法检测两组结肠组织白介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;免疫印迹法(WB)分别检测GDNF/GFRα1信号通路相关基因[GDNF、GFRα1、酪氨酸酶受体(RET)、核转录因子kappaBp65(NF-κBp65)、TNF-α]蛋白水平。结果:HE染色结果显示HAEC主要发生在结肠扩张段;ELISA法结果显示,与实验组乳鼠狭窄段肠管比较,扩张段肠管IL-10水平显著降低、TNF-α水平显著升高(均P<0.05);WB法结果显示,与实验组乳鼠狭窄段肠管比较,扩张段肠管GDNF、GFRα1、RET蛋白水平显著降低,NF-κBp65、TNF-α蛋白水平显著升高(均P<0.05)。结论:HD模型乳鼠结肠扩张段炎症程度较为严重,机制可能与GDNF/GFRα1信号通路受抑制,肠神经免疫调节系统异常有关。

稳定表达马NLRP3 HEK293T细胞系的构建及用于马NLRP3炎性小体的研究

为构建稳定表达马NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(eqNLRP3)的细胞系,并用于eqNLRP3炎性小体激活的研究,本研究采用同源重组的方法将经PCR扩增的eqNLRP3和GFP基因克隆至pLPCX中,构建重组表达质粒pLPCX-Flag-eqNLRP3-GFP,经PCR和测序鉴定正确后与pCGP、pVSV-G共转染HEK293T细胞,48 h后获得携带eqNLRP3的慢病毒。将该慢病毒感染HEK293T细胞,并采用嘌呤霉素筛选携带绿色荧光(GFP+)的单克隆细胞。采用western blot鉴定该细胞中eqNLRP3蛋白的表达、反应原性及细胞遗传稳定性。Western blot结果显示在146.1 ku处出现特异性条带,且传至1、4、7、10代的细胞均出现该条带,表明获得稳定表达eqNLRP3蛋白的HEK293T细胞系HEK293Teq NLRP3(2G1细胞)。采用NLRP3特异性激活剂尼日利亚菌素(Nig)处理2G1细胞1 h;将表达质粒pCDNA3.1-eqASC-HA转染2G1细胞,加入Nig处理1 h,采用激光共聚焦显微镜分别观察上述细胞中e NLRP3的聚化状态,及在2G1细胞中表达eqASC后能否形成ASC斑点(eqNLRP3-eqASC的复合物,即NLRP3炎性小体激活的典型特征)。结果显示,正常2G1细胞中呈绿色荧光的eqNLRP3弥散分布于细胞质中,加入Nig后弥散的eqNLRP3在细胞质中形成典型绿色荧光的点状聚集。转染表达eqASC质粒的2G1细胞中出现的红色荧光(eqASC)主要在细胞质中呈弥散性分布;转染表达eqASC的2G1细胞用Nig处理后形成2.5μm的中间呈绿色荧光四周呈红色荧光的典型ASC斑点。上述结果表明2G1细胞可以响应特异性激活剂并诱导eqNLRP3的聚化,招募ASC形成ASC斑点。将本实验室构建的iGLuc报告系统中的4种表达炎性小体蛋白质粒分别与EIV各蛋白对应质粒共转染HEK293T细胞,24 h后利用该报告系统检测各组细胞中的荧光素酶活性;采用western blot检测各共转染细胞中各EIV蛋白的表达对该系统中4种炎性小体蛋白表达的影响,通过上述两个试验筛选能够激活eqNLRP3炎性小体的EIV蛋白。iGLuc报告系统检测结果显示,仅表达EIV M2蛋白质粒的细胞上清中荧光素酶活性显著高于阳性对照组(P<0.05);western blot结果显示,EIV M2蛋白的表达对4种炎性小体蛋白的表达均无明显影响,表明EIV M2蛋白激活了eqNLRP3炎性小体。将表达EIV M2蛋白及表达eqASC的质粒共转染2G1细胞,24 h后经激光共聚焦显微镜观察以进一步验证上述结果。结果显示,该组细胞中带绿色荧光的eqNLRP3出现点状聚集,并招募细胞质中带红色荧光的eqASC形成了ASC斑点,与i GLuc报告系统筛选结果一致。上述结果表明,EIV感染对HEK293Teq NLRP3细胞系中的eqNLRP3产生了聚化效应,并招募ASC形成ASC斑点。本研究建立了稳定表达eqNLRP3蛋白的HEK293T细胞系,为马属动物病原感染激活NLRP3炎性小体的评价奠定了物质基础。

花鲈前脂肪细胞系的建立及油酸诱导分化

花鲈(Lateolabrax maculatus)前脂肪细胞系为探索鱼类脂肪细胞分化和脂肪沉积的调控作用及相关分子机制提供了一种新的体外模型。研究将花鲈腹腔脂肪组织用胶原酶消化后原代培养,再以胰酶消化后传代,总共经过150次传代培养后,得到花鲈前脂肪细胞系。进而,染色体核型分析表明该细胞系长期培养仍能保持正常表型,进一步使用线粒体cox1和cytb基因鉴定该细胞系来源于花鲈。用pEGFP-C1质粒转染细胞系,观察到明显的绿色荧光,表明可用于研究外源基因的表达。用不同浓度的油酸培养细胞系,3d后细胞有明显脂滴聚集,7d后脂滴达到最大;油红O染色表明,400μmol/L油酸诱导7d后细胞即可正常分化成熟。综上所述,实验建立了花鲈前脂肪细胞系,该细胞系形态典型、可正常分化,为后续研究鱼类脂肪细胞分化及脂肪沉积提供了良好的实验材料。

Tollip敲除猪肾细胞系的构建

旨在探究Toll作用蛋白(toll-interacting protein, Tollip)对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)增殖的影响,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tollip基因缺失的猪肾细胞系(porcine kidney cell line, PK-15),并通过PCR测序和Western blot确认敲除效果,然后利用CCK-8试剂盒测定Tollip缺失后细胞活力变化,确认敲除细胞与野生细胞无显著差异,用FMDV感染敲除细胞后,采用Western blot、间接免疫荧光、实时荧光定量和病毒滴度测定等方法测定病毒在敲除细胞系中复制情况。结果显示:感染FMDV后,敲除细胞与野生细胞相比,显著促进了病毒的复制。综上,在PK-15细胞上,成功构建Tollip缺失细胞系,且试验表明Tollip的缺失有助于FMDV的复制。研究结果为后续Tollip功能研究及抗病毒机制研究提供理论依据。

利用CRISPR/Cas9技术制备BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系

旨在利用CRISPR/Cas9系统构建BLG基因敲除牛乳腺上皮细胞系(bovine mammary epithelial cells,bMECs),同时检测BLG基因敲除后对细胞的影响。本研究利用体外切割试验筛选获得靶向牛的BLG基因的第一外显子序列的3条sgRNA,与CRISPR/Cas9表达载体电转染入bMECs,利用浓度为1.8μg·mL^(-1)嘌呤霉素和6μg·mL^(-1)稻瘟菌素双药筛和PCR分析鉴定获得BLG基因编辑的单克隆细胞株;利用Western blot(WB)验证细胞BLG表达;绘制生长曲线和CCK-8试验检测BLG基因敲除对bMECs细胞增殖的影响;同时根据sgRNA序列,对基因组上潜在脱靶位点进行PCR测序分析。经筛选和PCR序列分析,共筛选获得了9株BLG基因编辑细胞株,其编辑效率为90%(9/10),其中4株细胞株BLG基因大片段删除。序列分析结果显示,单克隆细胞株编辑位点呈现片段插入缺失和碱基替换等多种编辑类型,WB结果显示敲除细胞株BLG蛋白表达显著降低,且细胞生长曲线和CCK-8检测结果表明BLG基因敲除的细胞生长速度加快。本研究利用CRISPR/Cas9技术成果构建了牛乳腺上皮细胞BLG基因高效敲除方法,BLG基因敲除后可显著影响牛乳腺上皮细胞的增殖,为探究BLG敲除牛在乳腺上皮细胞水平探究其功能机制提供细胞模型。

承德无角山羊耳成纤维细胞系的建立与冷冻保存研究

【目的】试验以甜菜碱作为冷冻保护剂对承德无角山羊耳成纤维细胞系进行冷冻保存,旨在优化冷冻保护效果,以期在细胞水平上长期保存这一地方品种家畜的遗传资源。【方法】采用组织块培养法建立承德无角山羊耳成纤维细胞系,利用甜菜碱作为冷冻保护剂对其进行玻璃化冷冻,以不同浓度(5%、10%、15%、20%及25%)甜菜碱为试验组,以不同浓度(10%和20%)二甲基亚砜(DMSO)为对照组,对承德无角山羊耳成纤维细胞进行冷冻,复苏后检测细胞的存活率、增殖活力以及细胞中B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)/Bcl-2相关X蛋白(Bax)基因表达量,同时评估甜菜碱的毒性。【结果】本研究建立的承德无角山羊耳成纤维细胞系生长态势良好,细胞纯度较高,细菌、真菌和支原体3类微生物检测结果均为阴性,生长曲线呈S型,达到了建立成纤维细胞系的要求;当甜菜碱浓度为15%时细胞存活率最高,达90.86%,极显著高于对照组(P<0.01),细胞增殖活力及Bcl-2/Bax基因表达量均显著高于对照组(P<0.05),且甜菜碱的毒性远低于传统冷冻保护剂DMSO(P<0.05)。【结论】试验成功以甜菜碱作为单独的冷冻保护剂对承德无角山羊耳成纤维细胞系进行低温冷冻保存,从而保护了承德无角山羊的遗传资源。

日本鳗鲡心脏细胞系的建立及其在鳗鲡免疫应答研究中的应用

为建立稳定传代的鳗鲡细胞系用于鳗鲡免疫抗病机制的研究,研究利用组织块法建立了日本鳗鲡(Anguilla japonica)心脏细胞系(Anguilla japonica Heart cells,AJH)。AJH细胞在28℃、含20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培养基中培养,传代时间间隔3—4d,在第5代后更换为15%FBS传代培养。核糖体RNA基因分析显示细胞来源于日本鳗鲡。核型分析显示AJH细胞具有38条染色体,其中10条为中部着丝点染色体,10条为近中部着丝点染色体,18条为端着丝点染色体。病毒感染实验结果显示,鳗鲡疱疹病毒(Anguillad herpesvirus,AngHV)可在AJH细胞中增殖。利用多种试剂转染EGFP-AjLC3至AJH细胞,并通过流式细胞仪检测转染效率,结果显示AJH最高转染效率为(37.17±0.12)%。将AjIRF1真核表达质粒和AjIFNa、AjIFNc1启动子共转染至AJH细胞,利用双荧光素酶报告分析了过表达AjIRF1对AjIFN启动子荧光素酶活性的影响。结果显示AjIFNa和AjIFNc1启动子活性被显著上调,表明AJH细胞可用于体外的基因功能研究。经LPS刺激后,AJH细胞中AjTNF-α及AjIL-Iβ的表达水平明显上调;转染Poly I:C后,AJH细胞中AjRIG-Ia和AjRIG-Ib的表达水平明显上调,表明LPS和Poly I:C可诱导AJH细胞产生免疫应答。综上,研究所建立的日本鳗鲡心脏细胞系可为深入研究鳗鲡抗病毒、抗细菌免疫应答机制提供细胞实验模型。

乳腺癌原代细胞系为药物筛选和基础研究提供癌症新模型

背景和目的:2016年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)宣布不再使用NCI-60细胞系进行药物筛选,提示传统的肿瘤细胞系失去作为药物研发和基础研究工具的价值。NCI-60细胞“退休”原因是基于癌症细胞系和动物的实验结果没有在临床试验中获得对应的预期,导致绝大部分潜在药物临床试验失败。癌症细胞系失去价值归因于肿瘤细胞经过长期培养后,其增殖和转移等主要生物学行为和与之有关的关键蛋白质系统发生了根本改变,已不能代表患者的真实癌症特征。现阶段需要创立一种来源于患者新鲜癌症组织和具有清晰临床背景的新癌症模型。本研究旨在为药物研发和基础研究建立经济的患者来源的可以无限传代的乳腺癌原代细胞系。方法:乳腺癌组织在贵州医科大学附属医院乳腺外科收集。肿瘤组织样本收集得到贵州医科大学附属医院伦理委员会批准(伦理编号:2022伦理第313号),收集和使用肿瘤组织均遵守赫尔辛基宣言,患者的乳腺癌组织消化分离后在BCMI培养基中培养,待乳腺癌细胞增殖到一定数量时更换成DMEM培养基。乳腺癌细胞经短串联重复序列(short tandem repeat,STR)检测确定细胞特异性遗传学标志和来源。克隆形成实验和动物实验分析乳腺癌原代细胞系形成肿瘤的能力。结果:成功建立了6种乳腺癌原代细胞系。他们具有清晰的临床病理学特征,包括病理学标志性分子检测、临床诊断、治疗方案和结果以及确定的预后结果。STR检测确定了6种乳腺癌原代细胞系特异性遗传标志和确定了该细胞系的来源。克隆形成实验和动物移植实验说明乳腺癌原代细胞系增殖能力显著大于传统乳腺癌细胞系,二者在形成肿瘤能力方面存在明显的差异。结论:构建的6种乳腺癌原代细胞系为乳腺癌药物研发和基础研究提供了新的癌症模型。

稳定表达猪BRD4-BD1/2蛋白的猪肺泡巨噬细胞传代细胞系的构建及其用于ASFV增殖的效果观察

前期研究发现宿主表观遗传调控蛋白——含溴结构域蛋白质4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)有助于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的复制,为了深入研究BRD4对ASFV复制的影响,通过筛选出显著促进ASFV复制的BRD4-BD1/2结构域,利用慢病毒表达系统成功构建稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系,分析ASFV在3D4/21-BRD4-BD1/2细胞系与WT细胞系之间的复制差异。首先,以家猪基因BRD4-BD1/2为靶标,构建了含有3x Flag标签的重组质粒pLVX-IRES-puro-3x Flag-BRD4-BD1/2,并将其与质粒pMD2.G和pSPAX2共同转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装,获得具有感染能力的慢病毒。使用慢病毒感染3D4/21细胞后通过嘌呤霉素药物筛选,成功获得了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染3D4/21-BRD4-BD1/2细胞后CP204L和B602L基因的转录水平以及相应蛋白表达水平,并通过HAD50测定评价ASFV的复制能力。研究结果表明:成功构建了稳定表达BRD4-BD1/2结构域的3D4/21细胞系。与3D4/21-WT细胞系相比,BRD4-BD1/2稳定表达细胞系能够显著促进ASFV复制。本研究提供了深入研究BRD4蛋白在ASFV复制中功能的生物材料,并为ASFV疫苗候选株的开发提供了理论基础。

稳定表达circLAMP3的C57/B6-L和A549细胞系的构建

旨在构建稳定过表达环状RNA LAMP3(circLAMP3)的C57/B6-L和A549细胞系,为后续深入研究circLAMP3的生物学功能奠定基础。分别提取C57/B6-L和A549细胞总RNA,反转录后扩增circLAMP3全长序列,连接到pLC5-ciR载体上,得到pLC5-Mouse-circLAMP3和pLC5-Human-circLAMP3重组质粒。利用瞬时转染方法在HEK293T细胞上包装慢病毒,将慢病毒分别感染C57/B6-L和A549细胞,经嘌呤霉素筛选得到稳定表达circLAMP3的细胞系。利用荧光显微镜、PCR扩增、荧光定量PCR(qPCR)和Sanger测序对构建的细胞系过表达circLAMP3效果进行验证。结果表明,pLC5-Mouse-circLAMP3和pLC5-Human-circLAMP3过表达质粒构建成功,荧光显微镜下可见构建的C57/B6-L和A549细胞系表达强烈绿色荧光。PCR和qPCR结果可见过表达细胞系circLAMP3表达显著增强,Sanger测序结果表明circLAMP3环化位点正确。本研究成功构建了过表达circLAMP3的C57/B6-L和A549细胞系,为进一步探索circLAMP3在流感病毒复制中的生物学功能提供了生物材料。

稳定表达ATP5a细胞系的建立

目的:通过慢病毒表达系统构建稳定表达ATP5a蛋白的猪回肠上皮细胞IPI-2I细胞系,筛选获得过表达ATP5a的稳定细胞株,为研究ATP5a介导的生物学功能在病毒复制中的作用提供细胞模型。方法:提取HEK 293细胞的cDNA为模版,通过PCR扩增将ATP5a基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒p LVX-ATP5a-IRES-Zs GReen1,利用慢病毒包装系统将重组质粒与辅助质粒PSPAI2、PMG 2.0按照3:2:1共转染293T细胞,48 h后收集细胞上清获得稳定表达ATP5a蛋白的慢病毒颗粒,将重组慢病毒颗粒感染IPI-2I细胞,利用流式筛选技术获得阳性细胞,通过Western Blotting验证ATP5a的表达。结果:成功构建ATP5a过表达慢病毒载体,并通过倒置荧光显微镜观察显示获得纯度高于90%的稳定表达细胞株,Western Blotting结果显示ATP5a蛋白可在细胞系中稳定表达。结论:本研究成功建立了稳定表达ATP5a蛋白IPI-2I稳定表达细胞系,为ATP5a蛋白生物学特性研究奠定了基础。

表达猪流行性腹泻病毒N蛋白Vero细胞系的构建及初步鉴定

【目的】构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白的Vero细胞系,将有助于PEDV的进一步深入研究。【方法】本研究将N基因克隆到慢病毒载体中,构建重组质粒pLenti-CMV-N,利用慢病毒载体包装系统转染293T细胞,包装表达N蛋白的慢病毒颗粒,将慢病毒颗粒转导至Vero细胞,用潮霉素B初步筛选阳性细胞,采用终点稀释法,筛选表达PEDV N蛋白的Vero细胞系,最后进行鉴定。【结果】RT-PCR结果表明构建的细胞系基因组中存在N基因序列,Western blot和IFA试验验证了N蛋白在细胞系中的表达。【结论】本研究成功构建了表达PEDV N蛋白的Vero细胞系。

RNA结合蛋白RBPMS调控急性髓系白血病细胞系THP-1增殖与迁移

目的研究具有多重剪接功能的RNA结合蛋白(RBPMS)对携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病细胞系THP-1功能的影响。方法使用GEO数据库分析造血系统中RBPMS的表达情况;通过慢病毒感染THP-1细胞,RT-qPCR和Western blot检测RBPMS过表达效率;通过高通量测序检测RBPMS过表达后对THP-1细胞转录组的影响。分别用CCK-8法和流式细胞仪检测RBPMS过表达对白血病细胞增殖以及迁移能力的影响。结果RBPMS在携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病干细胞中异常低表达。RBPMS过表达后THP-1细胞的增殖和迁移能力显著降低(P<0.0001,P<0.05)。结论RBPMS可以抑制携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病细胞系的细胞增殖与迁移。

小鼠角膜上皮细胞永生化细胞系的建立及表型鉴定

目的探讨小鼠角膜上皮细胞永生化细胞系的建立方法,并鉴定其表型的稳定性。方法提取小鼠角膜上皮原代细胞,以猴空泡病毒40大T抗原(SV40-LT)慢病毒感染小鼠角膜上皮原代细胞建立永生化细胞系。通过HE染色与免疫荧光染色对角膜上皮组织表型和标记物(K12、Pax6、Ki-67)进行鉴定。提取原代角膜上皮细胞并对其角膜上皮细胞分层蛋白K14进行鉴定,观察细胞明场视野评估细胞形态学特征。对转染后的P1和P8代细胞的部分标志物(K12、Pax6、Ki-67、ABCG2、K14)进行鉴定。采用结晶紫染色法观察转染后的P1和P8代细胞克隆的形成能力。结果小鼠角膜上皮组织中K12、Pax6、Ki-67染色阳性;P1、P8代小鼠角膜上皮细胞中K12、Pax6、Ki-67、K14和ABCG2染色阳性,上述标志物阳性率比较,差异均无显著性(P>0.05),P1与P8代小鼠角膜上皮细胞克隆能力无明显差异(P>0.05)。结论使用SV40-LT慢病毒转染小鼠角膜上皮,成功建立永生化小鼠角膜上皮细胞系,表型稳定且稳定增殖。