Ras信号通路参与调控细胞凋亡作用的研究进展

细胞凋亡是由体内和体外因素触发的预先存在的细胞死亡过程引起的主动细胞死亡,通过清除老化、受损细胞来维持内部环境的稳定。细胞凋亡在生理和病理状态下均发挥重要作用,并受到细胞内多条信号通路的调节,影响细胞内物质的表达。目前已知Ras信号通路不仅广泛参与调控细胞生长增殖、分化和凋亡等多个生理病理过程,并具有促进细胞发生自噬性死亡的作用,然而,其参与调节细胞凋亡的具体机制尚未完全阐明。文章从细胞凋亡的分子机制出发,重点从线粒体凋亡途径、死亡受体凋亡途径、内质网应激凋亡途径相关凋亡途径,以及Ras信号通路在细胞凋亡调控中的研究进展进行综述。

卵巢癌中k-ras基因点突变及p53蛋白表达

目的 探讨k-ras基因点突变和p53蛋白表达在卵巢癌发生中的作用及致癌机制。方法 采用显微切割技术、半巢 式PCR RFLP技术和免疫组化染色检测55例卵巢癌及其交界性病变中的k-ras基因点突变和p53蛋白表达。结果 k ras基 因点突变率在黏液性腺癌(61.9%)明显高于浆液性腺癌(14.2%),在黏液性交界性腺瘤(61.5%)明显高于浆液性交界性腺 瘤(12.5%)。p53蛋白表达率在浆液性腺癌(80%)明显高于黏液性腺癌(52%),并随组织学分级而增高。结论 黏液性腺 癌主要通过腺瘤-交界性腺瘤-腺癌途径致癌,k-ras基因点突变是黏液性腺癌的早期事件,黏液性交界性腺瘤是黏液性腺癌 的癌前病变。浆液性腺癌主要通过生发上皮直接恶性转化形成,p53蛋白表达在浆液性腺癌的发生中起重要作用,是浆液性 腺癌的晚期事件。

西妥昔单抗联合FOLFIRI双周方案在野生型K-Ras基因晚期结直肠癌患者中的Ⅱ期临床观察

目的探讨西妥昔单抗联合FOLFIRI双周方案治疗K-Ras基因野生型的晚期结直肠癌的疗效及安全性。方法收集2008年1月至2010年6月44例K-Ras基因野生型的晚期结直肠癌患者,采用西妥昔单抗联合FOLFIRI双周方案进行治疗。具体方案:西妥昔单抗500mg/m2静滴,2周1次;伊立替康180mg/m2静滴30～90min,d1;亚叶酸钙200mg/m2静滴2h,d1;氟尿嘧啶(5-FU)400mg/m2静推,d1;5-FU 2400mg/m2持续静滴46h。14天为1周期。每例患者至少接受4个周期化疗后评价疗效。不良反应按照NCI CTC 3.0标准评价。结果全组44例患者均可评价疗效,获CR 2例(4.6%),PR 22例(50.0%),SD 17例(38.6%),PD 3例(6.8%);有效率为54.6%,疾病控制率为93.2%。单因素分析显示,有效率与肿瘤原发部位有关,与性别、年龄、转移脏器个数、转移部位和ECOG评分无关,疾病控制率与临床病理特征均无关;Logistic多因素回归分析显示,原发部位是影响疗效的独立因素(P=0.0455)。44例患者的中位总生存时间(OS)为25.7个月(95%CI:20.5～34.6个月),中位无进展生存时间(PFS)为8.4个月(95%CI:6.3～11.7个月)。Cox多因素分析显示,ECOG评分为影响PFS的独立因素,而性别为影响OS的独立因素。毒副反应主要为皮疹、中性粒细胞减少和消化道反应,以1～2级为主。结论西妥昔单抗联合FOLFIRI双周方案治疗晚期结直肠癌疗效肯定,毒副反应可以耐受,值得临床推广。

中药健脾康复方对大肠癌脾虚证患者K-ras和p53基因突变的抑制作用

目的:研究中药健脾康复方对大肠癌脾虚证患者K-ras和p53基因突变的抑制作用. 方法:选择中晚期大肠癌患者45例,随机分为治疗组和对照组.治疗组30例,在对症支持治疗的基础上口服健脾康复方,每日1剂,对照组15例,只给予对症支持治疗, 疗程为2 mo.观察治疗前后外周血K-ras基因突变率和血清突变型p53基因蛋白含量的变化. 结果:治疗组患者外周血K-ras基因突变率治疗后为26.7% (8/30),较治疗前的73.3%(22/30)显著下降(P<0.05);治疗组患者血清突变型p53基因蛋白含量治疗后(0.82±0.24 ng/L) 较治疗前(0.89±0.21ng/L)显著下降(t=2.34,P<0.05). 对照组以上两项指标治疗前后差异无显著意义. 结论:中药健脾康复方具有抑制K-ras和p53基因突变的作用.

检测胃癌患者外周血中K-ras和p53基因突变的临床价值

目的探讨检测胃癌患者外周血中K-ras和p53基因突变的临床意义。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)法,对我院收治的73例胃癌患者外周血中的K-ras和p53基因突变进行检测,并与20例非肿瘤疾病患者作对照。结果73例胃癌患者中有7例外周血中检测出p53基因突变,阳性率为9.6%;5例检测出K-ras基因突变,阳性率为6.8%。对照组外周血中均未检出K-ras和p53基因突变。有无肝转移的胃癌患者外周血p53和K-ras基因突变阳性率间差异均有统计学意义(P<0.05),不同分化程度及临床分期的胃癌患者外周血p53和K-ras基因突变阳性率间差异无统计学意义(P>0.05)。结论PCR-SSCP法检测外周血中K-ras和p53基因DNA有助于胃癌肝转移的诊断。

树突细胞负载K-ras突变多肽诱导抗胰腺癌免疫反应

背景与目的:由于大多数肿瘤抗原尚未确定,所以肿瘤的免疫治疗还处于临床探索阶段。k-ras原癌基因在胰腺癌中有特异性的表达,突变位点恒定,不失为一个良好的免疫靶位。本研究探讨以k-ras基因为靶点体外诱导胰腺癌被动免疫治疗的可行性,为临床进行胰腺癌个体化治疗提供实验依据。方法:利用RT-PCR法扩增k-ras基因,通过流式细胞术检测k-ras癌基因突变类型。合成含突变位点的多肽,负载外周血单核细胞来源的树突细胞(dendritic cell,DC),检测其表达率,对T细胞进行激发活化,M TT法检测肿瘤特异性T细胞对胰腺癌细胞Patu8988的杀伤作用。结果:Patu8988胰腺癌细胞株12位密码子点突变为GGT→GTT,12位氨基酸突变为缬氨酸。合成突变多肽能有效地在树突细胞表达突变位点,激发的肿瘤特异性T细胞(cytotoxic T lym phocytes,CTLs)能有效地杀伤相应的肿瘤细胞。结论:突变多肽能有效地诱导免疫细胞杀伤含k-ras突变基因的胰腺癌细胞,从而为胰腺癌的免疫治疗提供实验依据。

PCR-SSP法和基因测序检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变及其方式

目的检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因点突变及其突变方式,明确基因治疗靶点的碱基序列。方法针对K-ras基因第12位密码子点突变方式(CGT、GTT、GAT)设计顺序特异性引物(SSP),对人胰腺癌细胞株Patu 8988进行聚合酶链反应(PCR),扩增产物经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后判断该细胞株有无K-ras基因点突变及其突变方式。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因,扩增产物直接进行基因序列测定。结果PCR-SSP法检测人胰腺癌细胞株Patu 8988存在K-ras基因点突变,突变方式为GGT→GTT,其结果与基因序列测定完全相符。结论明确了人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变方式(GGT→GTT),为胰腺癌的下一步基因治疗研究打下了坚实的基础;PCR-SSP方法检测K-ras基因点突变简便、快速、经济且特异性高,有望在临床上成为早期诊断和鉴别诊断胰腺癌的实用检测方法。

小分子干扰RNA特异性抑制人胰腺癌细胞株PANC-1突变型K-ras基因表达的探讨

目的:研究小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)对人胰腺癌细胞株PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用。方法:构建真核表达载体pSilencer3.1-K-rasv12,转染PANC-1细胞后应用RT-PCR及Westernblot检测突变型K-ras基因mRNA及蛋白质表达变化;噻唑蓝(MTT)测定细胞生长曲线;流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功。RT-PCR光密度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:95.3%±2.5%、97.6%±2.8%、40.1%±3.1%,差异有统计学意义(P<0.05);Westernblot灰度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:96.1%±2.2%、98.5%±2.0%、36.5%±3.2%,差异有统计学意义(P<0.05);实验组细胞生长受到明显抑制,凋亡率较对照组明显升高(P<0.05)。结论:pSilencer3.1-K-rasv12能有效抑制突变型K-ras基因在人胰腺癌细胞株PANC-1中的表达,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡,为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法。

血清CA19-9与粪便K-ras、p53突变在胰腺癌诊断中的价值

目的:评价血清肿瘤标志物CA19-9和粪便K-ras以及p53基因突变对早期胰腺癌的诊断价值。方法:收集2006年9月～2009年3月在我院确诊的新发胰腺癌患者56例,胰腺良性疾病患者90例,进行血清肿瘤标志物CA19-9和粪便K-ras以及p53基因突变的检测,根据血清CA19-9的水平及粪便K-ras、p53基因突变率,进行临床分析。结果:血清CA19-9水平、粪便K-ras、p53突变率3项早期及中晚期胰腺癌组与胰腺良性疾病患者组比较,均有显著性差异(P<0.05);早期与中晚期胰腺癌组比较,均无显著性差异(P>0.05)。CA19-9检测(>37KU/L为阳性)诊断胰腺癌的敏感性为80.4%(45/56),特异性为73.3%(66/90)。粪便K-ras对胰腺癌诊断的敏感性为87.5%(49/56),特异性为50.0%(45/90)。粪便p53对胰腺癌诊断的敏感性为82.1%(46/56),特异性为70.0%(63/90)。结论:早期胰腺癌组血清CA19-9水平有81.8%的病例升高,粪便K-ras以及p53基因突变率分别为81.8%、77.3%,血清CA19-9水平对早期胰腺癌有较高的诊断价值,联合粪便K-ras以及p53基因突变的检测,可以显著提高早期胰腺癌的诊断效率。

外周血中EGFR、K-Ras基因突变与吉非替尼、厄罗替尼临床疗效分析

EGFR属于I型生长因子家族,具有酪氨酸激酶活性,与肿瘤发生与转移的多个环节,包括浸润、血管生成、细胞增殖和凋亡抵抗等相关。EGFR其酪氨酸激酶功能区基因突变影响着EGFR-TKIs的临床疗效。K-Ras是EGFR下游一个信号通路,它的突变提示EGFR-TKI治疗肺癌无效。

散发性大肠癌K-ras基因点突变研究及其临床病理意义

目的观察散性大肠癌K—ras基因12、13密码子点突变情况，探讨其与临床病理特征的关系。方法对2005～2009年问浙江省肿瘤医院确诊的140例大肠痛进行回顾性分析，并提取石蜡标本中癌组织DNA，经PCR扩增后应用焦磷酸测序技术检测K—ras基因第12、13密码子点突变情况。结果K—ras基因突变率397％（55／140），12密码子突变率78．2％（43／55），13密码子突变率21．8％（12／55）。共发现7种突变类型，包括12密码子（GGT→AT、GGT→AGT、GGT→TGT、GGT-→GTT、GGT→CGT、GGT→GCT）和13密码子（GGC→GAC），以12密码子（CGT→GAT）最常见，占突变总数41．8％（23／55）。K—ras基因突变与性别、年龄、大体类型、瘤体、原发部位、病理亚型、组织学分级、浸润深度、转移、Duke’S分期、脉管侵犯均无相关性（P〉0．05）；第12与13密码子突变在原发部位、淋巴结转移上差异有统计学意义（P〈0．05）。结论散发性大肠癌中K—ras基因突变率为39．7％，12密码子（GGT→GAT）突变是最常见类型。特定位点的突变与一些临床病理参数密切相关，其中12密码子突变在结肠癌中的发生率高，并易出现淋巴结转移。通过K—ras基因检测有助于指导临床开展大肠癌个体化治疗。

突变K-ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响

目的:构建含12密码子点突变的K-ras基因siRNA腺病毒载体,并研究其对人肺腺癌细胞株H441中突变K-ras基因表达的影响。方法:首先构建含有K-rasV12 siRNA的人H1启动子真核表达载体pSilencerH1/siK-rasV12;利用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切将人H1载体启动子和K-rasV12 siRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,形成转移质粒pAdTrack-H1/siK-rasV12,然后与腺病毒骨架质粒pAd/PL共转染至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切、序列鉴定。提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒AdH1/siK-rasV12,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染人肺腺癌H441细胞株,采用Westernblot检测感染前后K-rasV12蛋白表达水平的变化,观察AdH1/siK-rasV12对人肺腺癌细胞K-rasV12表达的影响。结果:成功构建K-rasV12s iRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制H441细胞中K-rasV12蛋白的表达。结论:构建的AdH1/siK-rasV12腺病毒能有效抑制突变K-ras基因在人肺腺癌细胞株H441中的表达,为肺癌的基因治疗提供了新的方法和材料。

蝙蝠葛酚性碱对胰腺癌细胞株BXPC-3移植瘤K-ras mRNA表达的影响

目的:探讨蝙蝠葛酚性碱(PAMD)抗胰腺癌作用靶点。方法:右腋皮下接种胰腺癌(BXPC-3)肿瘤细胞,经腹腔注射PAMD,连续用药21天,采用荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测肿瘤k-ras mRNA表达的情况。结果:PAMD高、中、低剂量均能下调BXPC-3荷瘤小鼠瘤组织中K-ras mRNA表达量,与模型对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:说明PAMD对BXPC-3荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用。

长期吸烟对大鼠肺组织p53、K-ras蛋白表达和基因突变的影响

目的观察长期吸烟对Wistar大鼠肺组织p53、K-ras表达的影响,研究吸烟与肺组织p53、K-ras基因突变的关系。方法建立Wistar大鼠被动吸烟模型。72只雄性Wistar大鼠分为实验组和对照组,实验组被动吸烟6个月,对照组正常呼吸条件下饲养,每个月末分别取6只大鼠肺组织,免疫组织化学观察p53和K-ras蛋白表达情况,聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测p53第5、6、7～8外显子和K-ras第1外显子的突变情况。结果免疫组织化学结果显示,p53蛋白表达于细胞核,K-ras蛋白表达于胞浆,吸烟组p53、K-ras蛋白表达强度与正常组比较有显著性差异。随着吸烟时间的增加,p53、K-ras蛋白阳性表达率均随吸烟时间的延长而升高。PCR-SSCP显示,p53基因随吸烟时间的延长突变率增加;K-ras基因突变率随吸烟时间延长增加不显著。结论吸烟可以导致大鼠肺组织p53、K-ras蛋白表达增强和基因突变率增加,随吸烟时间的延长呈上升趋势,为吸烟对肺的组织基因突变的判定及吸烟者肺癌的早期诊断提供理论依据,具有重要的理论和应用价值。

胃癌患者血浆p53、K-ras基因突变及临床意义

[目的]研究胃癌患者血浆中基因表达检测的可行性,探讨基因p53和K-ras突变与临床病理间的关系。[方法]应用PCR-SSCP分析技术,检测62例胃癌患者血浆中K-ras癌基因的突变情况。[结果]62例胃癌患者外周血和门静脉血中的p53、K-ras突变阳性率分别为8.06%、4.83%和38.71%、33.87%;无、有肝转移患者p53、K-ras突变阳性率分别为24.49%、22.45%和92.30%、76.92%;门静脉血p53、K-ras突变阳性率分别为38.71%、33.87%和56.45%、62.90%。[结论]胃癌的发生发展与血浆中癌基因K-ras与抑癌基因p53的突变有关。

逆转录病毒载体介导反义K-ras基因治疗胰腺癌的实验研究

目的:分离及克隆胰腺癌细胞基因组中K-ras基因片段,构建含反义K-ras癌基因逆转录病毒载体并探讨其对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响及可能的分子机制. 方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI 和EcoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3、PC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1、4及侧翼序列,将目的基因克隆入逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒,经PT-67细胞包装后获得重组逆转录病毒.将该重组逆转录病毒转染上述细胞,经G418筛选获得稳定细胞,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增生、凋亡和对胰腺癌p21蛋白表达;建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,观察反义K-ras基因体内治疗效果. 结果:成功构建含反义K-ras基因的重组逆转录病毒载体.反义K-ras基因抑制胰腺癌细胞增生,诱导细胞凋亡、下调K-rasmRNA和P21蛋白表达,并抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长. 结论:反义K-ras基因可使胰腺癌细胞增生受到抑制,并可诱导细胞凋亡和下调K-rasmRNA和P21蛋白表达.

let-7前体、K—ras基因在肺腺癌的表达及其相关性研究

目的探讨let-7前体、K-raa基因在肺腺癌中的表达及其意义。方法以GAPDH为内参，采用RT—PCR检测31例肺腺癌患者癌组织和正常组织中let-7前体、K—ras基因在肺腺癌中的表达。结果31例肺腺癌患者中let-7前体61．29％为低表达，K—ras基因67．74％为高表达，差异有统计学意义。let-7前体与K—rds基因存肿瘤组织表达具有显著相关性。结论let-7前体低表达与K—ras基因高表达在肺腺癌的发生、发展过程中可能具有某种协同作用。

结直肠癌K-ras基因突变检测及其意义

目的研究结直肠癌中K-ras基因突变率及突变类型,探讨结直肠癌K-ras基因野生型及突变型与患者临床参数的关系;通过基因测序,指导临床靶向药物用药。方法随机选取哈尔滨医科大学附属第三医院结直肠外科2008年9月至2010年3月收治的100例结直肠癌患者组织标本通过手术室取材、组织标本DNA提取、逆转录PCR、凝胶电泳、胶回收、直接测序等技术筛选K-ras基因突变标本进行统计分析,从中得出突变率及突变类型。结果共筛选出了34例(34%)K-ras基因突变标本,其基因突变均发生在第一外显子的第12及第13密码子。结果表明:第一外显子的第12密码子GGT突变为GAT或GTT;第一外显子第13密码子由GGC突变为GGT。其中并未发现第二外显子第59及第61位发生突变,及第一外显子12位13位同时突变。结论 K-ras基因结直肠癌中约有34%发生突变。在K-ras基因突变类型与患者的病期、病理类型、肿瘤的浸润深度、发病部位等因素无关。

帕尼单抗治疗K-RAS野生型转移性结直肠癌的观察与护理

目的针对帕尼单抗治疗K-RAS野生型转移性结直肠癌的疗效与护理,观察其化疗毒性反应。方法回顾41例转移性结直肠癌的病人,接受帕尼单抗治疗,治疗中对化疗毒性反应给予积极有效的护理。结果截止至2013年7月,41例转移性结直肠癌病人,部分缓解6例,稳定20例,进展13例,无法评价2例,出现不同程度的皮疹41例,注射部位反应或者注射部位周围的反应1例,肝肾功能损害较轻。结论帕尼单抗治疗在曾接受过治疗的、患有野生型K-RAS转移性结直肠癌患者中,取得较好的疗效,毒副反应不可忽视,积极有效的护理可预防和减少不良反应的发生,确保整个治疗顺利进行。

伴有K-ras基因突变和HPV感染的结肠原发性鳞状细胞癌1例并文献复习

目的探讨结肠原发性鳞状细胞癌的临床病理学特征。方法对1例结肠原发性鳞状细胞癌进行病理形态观察、免疫表型分析、HPV原位杂交检测、K-ras和BRAF基因突变检测。结果镜下见典型鳞状细胞癌特点。免疫表型:HCK、p40阳性,CDX2、MUC2阴性,HPV原位杂交检测呈阳性,K-ras基因显示突变,BRAF基因为野生型。结论结肠原发性鳞状细胞癌极为少见,诊断时要严格把握诊断标准,应常规检测HPV及K-ras基因突变以指导临床治疗。