中华绒螯蟹Na^+-K^+-Cl^-协同转运蛋白基因的克隆和功能分析

为研究Na+-K+-Cl-协同转运蛋白(NKCC)基因在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)应对高盐胁迫过程中的作用,采用RACE技术首次克隆到中华绒螯蟹NKCC基因全长序列,运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对中华绒螯蟹NKCC基因进行组织定量,并进行生物学信息分析.结果表明:该基因的cDNA全长为4127bp,其中5'非编码区(UTR)长度为18bp,3'非编码区(UTR)长度为944bp,开放阅读框(ORF)长度为3165bp,编码1054个氨基酸.理化分析预测其分子量为51.066kDa,理论等电点为4.65.预测中华绒螯蟹NKCC二级结构由12个跨膜结构域组成.同源对比结果显示:中华绒螯蟹NKCC的氨基酸序列与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)NKCC相似度最高,为86.17%.系统进化分析表明中华绒螯蟹NKCC与拟穴青蟹、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、可口美青蟹(Callinectes sapidus)、蓝蟹(Callinectes sapidus)聚为一支.不同组织的荧光定量结果显示:NKCC基因在中华绒螯蟹的肠、脑神经节、胸神经节、鳃、胃、肝胰腺、肌肉、眼、心脏和血清中均有表达且在中华绒螯蟹肠的表达量最高.在盐度为25‰的急性胁迫下,NKCC基因在中华绒螯蟹肠中的表达量随着胁迫时间延长变化显著(P<0.05),并在胁迫72h后恢复稳定.以上结果显示,NKCC基因参与了中华绒螯蟹渗透压调节,并在其渗透压平衡中发挥重要作用.

鱼类离子细胞及离子通道的研究进展

渗透压调节与鱼类生命活动密切相关,离子细胞与离子通道是渗透压调节的重要细胞和通路。本文结合近期国内外在渗透压调节方面的研究热点,论述鱼类离子细胞与离子通道的研究进展,并做出展望。主要从离子细胞的命名演变及离子细胞亚型的类型和两种离子通道的研究进展进行论述。离子细胞的命名从"氯细胞(chloride cells,CCs)"、"线粒体丰富的细胞(mitochondrion-rich cells,MRCs或MR)"发展到"离子细胞(ionocytes)",其中还有PNA+、PNA-、Ⅰ型MR细胞、Ⅱ型MR细胞、Ⅲ型MR细胞、Ⅳ型MR细胞相继因不同的功能而被独立进行命名。两种离子转运通道是:囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)和Na+/K+/2Cl-协同转运蛋白(NKCC),CFTR在离子细胞的尖端处表达,而NKCC则在离子细胞基底进行表达调控,两者在渗透压调节中处于下游层次,可直接反应离子调控的水平。

NKCC1、KCC2及mTOR相关蛋白4E-BP1在外伤性癫痫中的表达及意义

目的探讨主要表达于神经元细胞膜上的NA^+-K^+-2CL-转运体(NKCC1)、K^+-CL-转运体(KCC2)及表达于神经元细胞质中m TOR通路信号蛋白4E结合蛋白1(4E-BP1)在外伤性癫痫(PTE)癫痫灶中的表达及临床意义。方法收集2010年1月至2015年12月福建医科大学附属第一医院神经外科外伤性癫痫患者术后脑组织标本14例作为实验组;选取脑外伤患者行减压或清创手术获取的和各种病变患者手术入路不可避免要切除的正常脑组织8例作为对照组。用Western blot和实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测14例PTE癫痫脑组织、8例对照组"正常脑组织"NKCC1、KCC2、4E-BP1的表达。结果 Western blot显示PTE病灶脑组织中4E-BP1、NKCC1相对灰度值(0.61±0.12、0.92±0.19)高于正常脑组织(0.27±0.05、0.67±0.66),差异有统计学意义(P<0.05)。PTE病灶脑组织中KCC2相对灰度值(0.58±0.99)低于正常脑组织(0.72±0.06),差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示,PTE病灶脑组织中4E-BP1、NKCC1相对灰度值(30.84±1.32、27.81±1.92)高于正常脑组织(26.94±1.24、23.52±0.74),差异有统计学意义(P<0.05)。PTE病灶脑组织中KCC2相对灰度值(21.55±1.01)低于正常脑组织(24.59±1.02),差异有统计学意义(P<0.05)。PTE组中NKCC1/KCC2比值(1.29±0.11)高于对照组(0.96±0.26),差异有统计学意义(P<0.05)。结论NKCC1、KCC2和m TOR通路信号蛋白4E-BP1的异常改变,可能是外伤后脑组织组织学改变及反复癫痫发作的重要分子机制。

MK-801诱导的精神分裂症大鼠脑组织PV、GAD67和KCC2的表达变化

目的通过对地佐环平(MK-801)诱导的精神分裂症(SZ)大鼠脑组织小清蛋白(PV)、谷氨酸脱羧酶67(GAD67)以及K+-Cl-协同转运蛋白2(KCC2)表达的比较研究,探讨围产期NMDA受体阻断剂致SZ的γ-氨基丁酸(GABA)机制。方法 36只新生雄性Sprague-Dawley大鼠于出生后(postnatal,P)6 d随机分为2批,每批又随机分为正常对照组、SZ发育模型组和SZ慢性给药模型组。SZ发育模型组于P7～10 d皮下注射0.1 mg/kgMK-801,每日2次;SZ慢性给药模型组于P47～60 d腹腔注射0.2 mg/kg MK-801,每日1次;对照组和各模型组大鼠于相应时段注射0.9%的生理盐水。P63 d,第1批大鼠断头取脑,多聚甲醛固定后行组织切片,以免疫组化方法检测内侧前额叶皮质(mPFC)和海马CA1区PV及GAD67的表达情况;第2批大鼠处死后取mPFC和海马组织匀浆,以免疫印记方法检测mPFC和海马组织KCC2的表达水平。结果两模型组mPFC和海马CA1区PV以及GAD67的表达水平显著低于对照组(P<0.05);SZ发育模型大鼠mPFC和海马CA1区的KCC2表达水平显著低于慢性给药模型组和对照组(P<0.05)。结论 MK-801诱导的SZ发育模型可模拟SZ患者大脑PV和GAD67的表达改变,并可能通过下调KCC2的表达影响mPFC和海马GABA递质系统的发育。