一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法

目的:探讨一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法,使细胞内环境保持稳定,改善常规全细胞膜片钳破膜所造成的封接不稳定。方法:以人肠系膜动脉平滑肌细胞为研究对象,采用穿孔全细胞膜片钳技术,记录人肠系膜动脉平滑肌细胞上大电导钙激活钾通道(big-conductance Ca2+-activated potassium channels,BKCa)宏观电流以及自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)。结果:采用这种穿孔全细胞膜片钳技术,能有效记录到人肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa和STOCs。结论:穿孔膜片钳技术是一种简便而有效的记录全细胞电流的实验方法,该方法的建立为今后更深入的研究提供实验基础。

一种有效记录成骨细胞L型钙通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法

目的:探讨一种有效记录成骨细胞L型钙通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法。此方法使玻璃电极与细胞内液保持电化学连续性,使细胞内环境保持稳定,改善常规全细胞膜片钳破膜造成的破膜难和封接不稳,以及常规全细胞膜片钳破膜后造成的封接不稳。方法:以成骨细胞为研究对象,采用β-七叶素穿孔全细胞膜片钳技术,记录骨细胞L型钙通道电流。结果:采用这种穿孔全细胞膜片钳技术,能有效记录到成骨细胞上L型钙通道电流。结论:穿孔膜片钳技术是一种简便而有效的记录全细胞电流的实验方法,该方法的建立为今后更深入的研究疾病中成骨细胞的病理生理机制提供实验基础。

应用穿孔全细胞膜片钳记录技术研究培养大鼠耳蜗螺旋神经节神经元的基本电生理特性

为了深入了解耳蜗螺旋神经节(SG)神经元的基本电生理特点,本研究首先成功培养了急性分离的大鼠SG神经元,然后采用穿孔全细胞膜片钳记录技术观察了培养SG神经元的基本电生理特性。结果表明,可从培养的SG神经元记录到动作电位,且不同的SG神经元具有异质性的放电特征。上述结果提示穿孔全细胞膜片钳记录技术可用于体外培养耳蜗SG神经元的电生理特征研究,为开展听觉信息传导和调控的功能研究开辟了新途径。

穿孔膜片钳记录猪冠状动脉平滑肌细胞K^+电流技术初探

常规全细胞膜片钳模式形成的同时,细胞内液与电极液交换造成细胞内物质丢失,此现象对小细胞的影响更为明显。穿孔膜片钳技术使电极与细胞胞质之间保持电学连续性,它使细胞内环境保持稳定,利于研究胞内信息传导机制,并可改善常规全细胞膜片钳时破膜所造成的封接稳定性的破坏,有望提高实验的成功率。本研究报道应用此技术在猪冠状动脉平滑肌细胞上记录的全细胞K+电流和由大电导钙激活钾通道BKCa所介导的自发瞬时外向电流ISTOCs。

快反应电压敏感染料脑片功能性成像结合全细胞膜片钳记录的体外研究

在大脑的许多区域，局部回路的连接被分离成特定的层状体或神经纤维球，如海马、大脑新皮质和嗅球等。在解剖学上这些区域相互分隔。而功能成像对表现回路特征发挥着独特的作用。电压敏感染料成像（voltage-sensitive dye imaging）是通过探测相应脑组织的电活动或局部新陈代谢活动所引起的光学性质的微小变化来进行功能成像的。

红景天苷体外灌流对大鼠心肌细胞膜钠通道电流的影响

目的观察红景天苷体外灌流对SD大鼠心肌细胞膜钠通道电流(INa)的影响。方法 SD大鼠颈部脱臼处死后,开胸剪断主动脉并取下心脏,采用Langendorff逆行主动脉灌流法急性分离SD大鼠单个心室肌细胞,置于培养皿,以电极外液灌流冲洗。置入微电极,充灌电极内液,采用全细胞模式的膜片钳技术检测INa,电流稳定后灌注红景天苷100μmol/L,再次检测INa。绘制电流-电压关系(I-V)曲线、稳态激活曲线及稳态失活曲线,观察灌流前后大鼠心肌细胞INa及相关曲线的变化。结果红景天苷灌流后INa幅值增加。红景天苷灌流后INa I-V曲线下移,但不改变I-V曲线形状、最大激活电位和反转电位。红景天苷灌流前后INa密度最大峰值分别为(-29.71±4.37)、(-58.66±8.21)p A/p F,灌流前后相比,P<0.05。红景天苷灌流前后INa稳态失活曲线的半数失活电压分别为(-66.67±1.57)、(-61.45±1.57)m V,半数失活电压向正值方向移动,斜率因子分别为-10.23±1.30、-7.71±1.12,灌流前后半数失活电压相比,P<0.05。红景天苷灌流前后INa稳态激活曲线半数激活电压差异无统计学意义。结论红景天苷体外灌流可使SD大鼠心肌细胞膜INa的I-V曲线下移,增加电流幅值,该作用可能与红景天苷增加钠通道失活电位、抑制电流失活有关。

AngⅡ对人心房肌细胞膜钙通道电流的影响及替米沙坦的拮抗作用

目的观察AngⅡ对人心房肌细胞膜钙通道电流的作用,揭示其参与房性心律失常的电生理机制,为应用AngⅡ受体拮抗剂治疗房性心律失常提供实验依据。方法急性分离单个人心房肌细胞,采用全细胞膜片钳方法记录L型钙电流(ICaL)。实验分4组对照组,AngⅡ(0.1μmol/L)组,替米沙坦(0.01μmol/L)组,AngⅡ+替米沙坦组。结果与对照组相比,0.1μmol/LAngⅡ组使人心房肌细胞膜ICaL峰值电流密度显著增加(12.74±1.65vs-5.78±0.82pA/pF,P<0.05)。0.01μmol/L替米沙坦组对人心房肌细胞膜ICaL无显著影响(-5.70±0.79pA/pF),但可拮抗AngⅡ的作用,AngⅡ+替米沙坦组的ICaL峰值电流密度(-7.38±0.91pA/pF)与AngⅡ组相比有显著差异(P<0.05)。结论AngⅡ显著增加人心房肌细胞膜ICaL峰值的电流密度。替米沙坦可拮抗AngⅡ对人心房肌细胞膜ICaL的作用。

AngⅡ对人心房肌细胞膜钙通道电流的影响及卡维地洛的拮抗作用

目的:观察AngⅡ对人心房肌细胞膜钙通道电流的影响及卡维地洛的拮抗作用,为应用卡维地洛治疗房性心律失常提供实验基础。方法:急性分离单个人心房肌细胞,采用全细胞膜片钳方法记录L-型钙电流(LCaL)。实验分4组:对照组,AngⅡ(0.1μmol/L)组,卡维地洛(1μmol/L)组,AngⅡ+卡维地洛组。结果:与对照组相比,0.1μmol/LAngⅡ使人心房肌细胞膜LCaL峰值电流密度明显增加(-12.74±1.65vs-5.78±0.82pA/pF,P<0.05)。1μmol/L卡维地洛对人心房肌细胞膜ICa-L无明显影响(-5.72±0.77pA/pF).但可拮抗AngⅡ的作用;AngⅡ+卡维地洛组的ICa-L峰值电流密度(-8.03±0.84pA/pF)与AngⅡ组相比有显著差异(P<0.05)。结论:AngⅡ对人心房肌细胞具有明显的电生理学作用,0.1μmol/LAngⅡ可促进人心房肌细胞膜ICaL.卡维地洛可拮抗AngⅡ对人心房肌细胞膜ICaL的作用。

P物质增强大鼠急性分离DRG细胞膜ATP激活电流

已有的资料证明：背根神经节(DRG)神经元膜存在有SP受体(Dray和Pinnoek．1982；司军强和李之望，1995；李之望等，1995；胡宏镇等，1995)以及ATP受雄(Krishtal et al，1982；Bean et al，1990；Li et al。1993；胡宏镇和李之望，1995)。本文研究的目的是探索SP对ATP受体是否有调制作用。实验在用酶和机械分离的大鼠DRG神经元应用全细胞膜片钳技术记录ATP-激活内向电流，在所检测的85个细胞中绝大多数细胞均对ATP敏感(82／85，96．5％)。

穿孔膜片钳记录肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道方法初探

目的利用穿孔全细胞膜片钳技术以提高记录到稳定的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large conductance Ca2+-activated K+channels,BKCa)电流的成功率。方法在两性霉素B穿孔全细胞膜片钳下记录大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa宏观电流和自发性瞬时外向电流(spontaneous transient outward currents,STOCs)。结果采用两性霉素B穿孔全细胞膜片钳技术,记录到BKCa和STOCs概率明显增加,且可以维持3小时。结论通过穿孔全细胞膜片钳可以记录到稳定的且维持时间长的大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa电流。

Amphotericin B在全细胞穿孔膜片钳技术中的应用研究

目的:为研究海德氏突触的电生理特性,建立用amphotericin B穿孔的膜片钳技术。方法:本文应用两性霉素B(amphotericin B)在小鼠脑干的calyx细胞上进行穿孔膜片钳技术的研究。结果:应用amphotericin B进行穿孔后,通道电流衰减现象显著变慢。Amphotericin B的最适浓度为400μg/ml。结论:本研究摸索出了一种稳定的穿孔膜片钳全细胞记录技术,可以更有效,更真实的反应神经元通道电流的电生理特性。为穿孔膜片钳技术在听觉信息传导和调控研究中的应用提供了基础资料。

穿孔膜片钳方法记录L型钙通道及脱氢紫堇碱对其影响的研究

目的比较全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法记录大鼠心室肌细胞L型钙通道电流随时间经过的变化差异,并观察脱氢紫堇碱对L型钙通道的影响。方法采用全细胞膜片钳和穿孔膜片钳方法记录急性分离的大鼠心室肌细胞L型钙通道电流。结果采用全细胞膜片钳法记录到的L型钙通道电流峰值在15 min内衰减了(34±23)%(n=10),采用穿孔膜片钳方法记录到的L型钙通道电流峰值15 min内仅衰减了(2.7±3.4)%(n=9);采用穿孔膜片钳方法能够记录到人参皂苷Re(100μmol.L-1)的抑制效应,而采用全细胞膜片钳方法产生的电流衰减几乎完全掩盖了人参皂苷Re的效应。脱氢紫堇碱(10,100μmol.L-1)能够抑制L型钙通道的电流峰值,抑制率分别为(9±7.5)%(n=5);(28.6±8.5)%(n=5)。结论穿孔膜片钳方法较全细胞膜片钳方法在对L型钙通道电流记录方面更具稳定性和准确性,脱氢紫堇碱能够浓度依赖性的抑制L型钙通道。

人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性的研究

目的 研究人非小细胞肺癌细胞膜钾离子通道特性。方法 采用原代培养的非小细胞肺癌细胞、肺部良性病变和癌旁支气管上皮细胞 ,应用膜片钳全细胞记录方式检测细胞膜钾离子通道特性。结果 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜K+ 通道表达的K+ 电流具有电压依赖性 ,能被K+ 通道阻断剂TEA阻断。鳞癌细胞膜电流具有失活趋势和内向整流特点 ;腺癌细胞膜电流具有不失活特性 ,无内向整流特点。TP =5 0～ 90mV时 ,时间常数 (τ值 )为 3.6～ 9.8ms。非小细胞肺癌细胞膜电容为 ( 15 .35± 0 .65 )pF ,K+ 电流密度为 ( 12 1.0 8±8.35 )A/F。 ( 2 )非小细胞肺癌细胞膜K+ 电流幅度、电流密度和膜电容较支气管上皮细胞明显增高 (P <0 .0 0 1) ,癌细胞τ值显著小于支气管上皮细胞的τ值 (P <0 .0 0 1)。结论 ( 1)非小细胞肺癌细胞膜存在与延迟整流性类似的钾离子通道 ,且表达明显增加 ,活动明显增强。 ( 2 )检测肺癌细胞膜K+ 通道可为研究肺癌发生、发展。

碘化N-正丁基氟哌啶醇对大鼠心室肌细胞膜钾通道的影响

目的研究碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)对大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾通道的影响。方法采用酶急性消化法分离得到单个大鼠心室肌细胞,应用膜片钳全细胞记录技术观察F2对大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流(Ito)的影响。结果F2可剂量依赖地抑制Ito,IC50为0.28mmol·L-1。F2可使Ito的稳态失活曲线左移,半量膜电位Vmid变负,斜率因子S变大;但对激活曲线几乎无影响;对Ito灭活后再复活时程无影响。结论F2对心室肌膜Ito具有抑制作用。

心肌细胞的急性分离及瞬时外向钾电流的记录

目的在利用全细胞膜片钳技术研究离子通道时,分离出结构功能完整、生理状态良好、耐钙的单个心肌细胞至关重要,文中主要探讨心肌细胞分离及瞬时外向钾电流记录的影响因素。方法使用改良的体外心脏恒温灌流,酶解消化得到单个心肌细胞,并采用全细胞膜片钳技术记录瞬时外向钾电流。结果用全细胞膜片钳技术可获得生理状态良好的心肌细胞,并成功的记录到瞬时外向钾电流。结论全细胞膜片钳技术方法简便、稳定,细胞存活率高,并且易于进行全细胞膜片钳实验。

人肺腺癌细胞膜钾通道特性研究

目的研究人肺腺癌细胞系A-549细胞膜离子通道特性。方法采用膜片钳技术全细胞记录方式检测A-549细胞膜离子通道的特性。结果人肺腺癌细胞系A-549细胞获得稳定的高阻封接的最佳培养时间是细胞传代培养48 h,细胞膜跨膜离子电流具有电压依赖性,在500 ms内不失活,其翻转电位为-70^-80 mV,与细胞膜K+电流的平衡电位相一致。该细胞平均膜电容为(15.13±1.02)pF,TP为+110 mV时细胞膜跨膜通道的电流密度为(48.73±8.58)pA/pF。TP为-40^+110 mV时,细胞膜跨膜通道激活时间常数为12.57~3.14 ms。该跨膜电流能被钾通道阻断剂TEA和CsCl所阻断,表明该跨膜离子电流为K+电流。结论在人肺腺癌细胞系A-549细胞膜上存在一种类似于神经元和肌肉细胞膜上的延迟整流性K+通道。

泮库溴铵对大鼠颈上交感神经元全细胞N型钙通道电流的影响及其机制的探讨

目的 研究泮库溴铵对大鼠颈上交感神经元细胞N型钙通道电流的影响。方法 酶 -机械法急性分离大鼠颈上交感神经元 (SCG)细胞。采用全细胞膜片钳技术 ,记录N型钙通道电流。通过自制“Y”型加药系统将以标准细胞外液稀释的泮库溴铵灌流至细胞周围。记录灌流前、灌流 30s后和冲洗 30s后的N型钙电流。在细胞内液内加入非水解性G蛋白抑制剂GDP·βS ,然后再以 10 μmol/L泮库溴铵灌流后观察N型钙电流的变化。结果 1、4、10、4 0 μmol/L的泮库溴铵可以使钙电流分别增强 12 .6 %、2 4 .2 %、5 6 .6 %和 2 1.9% ,而 10 0和4 0 0 μmol/L的泮库溴铵则分别使N型钙电流减少 14 .1%和 2 5 .5 %。在电极内液中加入G蛋白的非水解性竞争性拮抗剂GDP·βS后 ,10 μmol/L的泮库溴铵对N型钙电流的增强作用消失。 结论 较低浓度的泮库溴铵通过抑制G蛋白调控机制增强交感神经元N型钙通道电流 。

人肺腺癌A549细胞膜钾离子通道特性与细胞增殖关系的研究

背景与目的肺癌的发生发展、侵袭和转移均受肺癌相关基因的调控,而相关基因的表达、缺失或/和突变常是通过细胞膜信号传导系统和细胞膜离子通道实现的。本研究观察了人肺腺癌细胞系A549细胞膜钾离子通道的特性,以探讨应用钾通道阻断剂抑制肺腺癌细胞增殖的可行性。方法以人肺腺癌细胞系A549细胞为研究对象,采用全细胞膜片钳技术记录细胞膜离子通道特性;通过细胞体外增殖试验,观察钾通道阻断剂四乙胺(TEA)对细胞增殖影响。结果A549细胞在保持电压为-70mV,测试电压-30^+110mV时,记录到一种跨膜电流,该跨膜电流具有电压依赖性、外向整流特性,并且500ms内不失活,可被钾通道阻断剂TEA阻断;细胞体外增殖试验显示,20、40和60mmol/L的TEA作用24h能明显抑制人肺腺癌A549细胞的体外增殖,而0.2和2mmol/L的TEA对细胞的体外增殖无明显抑制作用。结论人肺腺癌细胞系A549细胞中存在外向性电压门控性钾通道,该钾通道可被TEA阻断;钾通道阻断剂TEA能抑制A549细胞的体外增殖,抑制作用与TEA存在剂量依赖关系。

一种适用于膜片钳研究的豚鼠心室肌细胞急性分离方法

目的获得适用于心肌细胞膜片钳研究的单个心室肌细胞。方法应用酶消化和机械分离的方法分离出生25~30 d的豚鼠心室肌细胞,从形态学及电生理学方面鉴定急性分离的豚鼠心室肌细胞活性,在电镜下观察活性较好的豚鼠心室肌细胞形态学特点,并选用活性较好的单个心室肌细胞进行膜片钳钳制,记录心室肌细胞Ik电流。结果形态学方面：活性较好的心室肌细胞边缘整齐,横纹清晰,膜的弹性较好,立体感较强。电生理方面：选用活性较好的单个心室肌细胞记录出典型的Ik电流曲线。结论该法可获得形态和生理特性良好的单个心室肌细胞。该方法适用于心肌细胞膜片钳研究,对深入探讨药物和毒物对心肌细胞离子通道及信号转导机制的作用机制具有重要价值。