上调K^(+)/Cl^(-)共转运体2可作为癫痫治疗的新靶点吗?

癫痫是由多种病因引起的一种常见中枢神经兴奋性疾病,以脑神经元过度兴奋导致发作性、短暂性、反复性的大脑功能紊乱为特征,其致病机制主要与氯稳态和氨基丁酸(GABA)能神经元抑制功能失调相关。鉴于目前抗癫痫药物存在副作用多、疗效不佳等缺点,深入阐明癫痫的致病机制、寻找新型癫痫治疗措施具有很大的临床迫切性。最新研究发现上调K^(+)/Cl^(-)共转运体2(KCC2)活性,可促进神经元内Cl^(-)外排,降低胞内Cl^(-)浓度来维持GABA能介导的超极化抑制功能,从而防止神经元的过度兴奋。本文依据既往研究就KCC2的结构与功能、KCC2在维持氯稳态和GABA能神经元抑制功能中的作用,以及KCC2功能障碍与癫痫发生相关的研究进展进行总结,探讨靶向调控KCC2功能成为治疗癫痫新靶点的潜在可能性,并进一步讨论KCC2功能与中枢神经兴奋性疾病研究中面临的主要问题。

盐响应信号途径SOS与植物K^+吸收关系

【目的】在盐胁迫条件下研究SOS突变体K+吸收的变化,旨在解析植物高盐胁迫响应与K+吸收的关系。【方法】以SOS信号途径的3个主要基因sos1、sos2、sos3突变体和野生型拟南芥(WT)为试验材料,在含有不同Na+/K+浓度比例的培养基上处理试验材料,观察各突变体与WT的表型差异,进行根系扫描、测定植物的RGR(相对生长率),植株体内Na+、K+的含量,计算植株体内Na+/K+浓度比值,同时,利用qRT-PCR分析K+转运体基因AKT1、AKT2、SKOR在突变体和WT间的表达差异。【结果】不同浓度K+进行处理时,突变体和WT之间没有明显差异;在30 mmol.L-1NaCl处理下,植株形态、RGR和体内Na+/K+浓度比值,体内K+浓度的测定结果显示,当K+浓度从0.2 mmol.L-1增加到60 mmol.L-1时,K+浓度增加缓解了高盐胁迫对突变体生长的抑制作用。所有植株体内的Na+/K+值降低,体内K+浓度提高。在相同处理条件下,突变体的Na+/K+值高于WT,WT体内K+浓度高于突变体;当K+浓度升高到80 mmol.L-1时,突变体的生长又重新受到抑制。所有植株体内的Na+/K+值升高,体内K+浓度降低。3个K+转运体AKT1、AKT2、SKOR的real-time PCR分析结果显示,在30 mmol.L-1NaCl处理时,在低钾条件下(0.2 mmol.L-1K+)AKT1和SKOR表达比较低,而高钾条件下(20.05 mmol.L-1K+或者60 mmol.L-1K+)AKT1、AKT2、SKOR的表达量没有明显差异,这3个基因的表达方式在突变体之间没有明显的差异。【结论】在中度盐胁迫条件下,外界K+浓度增加可以缓解盐胁迫对植物生长造成的抑制作用,但是当外界一价阳离子的总浓度高于110 mmol.L-1时,拟南芥的生长重新受到抑制。SOS信号途径对植物K+吸收没有直接的调节作用。

K^+/H^+逆向转运体基因PpeKEA在桃开花期的表达及对钾肥施用的响应

从‘霞晖8号’桃花中克隆并鉴定了6个K^+/H^+逆向转运体基因Ppe KEA,在转录水平分析其在桃花发育不同时期的表达模式及对钾肥施用的响应,明确关键基因并验证其功能。结果表明,钾肥施用显著增强盛花期桃花的鲜样质量,提高花朵钾素富集水平。PpeKEA1~PpeKEA6在桃花开放不同时期的表达水平存在差异,均在盛花期达到最高,其转录水平对施用钾肥的响应不同;PpeKEA1在整个桃花开放不同时期的表达量较高,钾肥处理显著增强其在花蕾膨胀期和初开期的表达并抑制其在败落期的表达量;表达载体pDR196-shortKEA1能赋予酵母菌感受态细胞AXT3突变体适应高钾环境而正常生长,说明PpeKEA1的C端区域具有调节桃花组织内K^+转运和平衡的功能。本研究表明PpeKEA1是一个桃花开放过程中调节K^+平衡的K^+/H^+逆向转运体,并可能在桃树钾素营养的动态平衡中起着重要作用。

葡萄KEA家族基因的克隆、鉴定及表达分析

【目的】从葡萄中克隆并鉴定KEA家族基因,在转录水平探索其组织特异性表达特征及对缺钾、脱落酸(ABA)、氯化钠(NaCl)与山梨糖醇(sorbitol)等胁迫的响应情况,明确主效基因。【方法】通过同源克隆法,在葡萄基因组中筛选并鉴定KEA家族基因;利用MEGA 7.0软件中的邻接法建立9种不同植物(葡萄、拟南芥、水稻、玉米、高粱、短柄草、白杨、梨和苹果)KEA家族成员的系统进化树;借助多种生物信息学软件分析葡萄KEA家族基因及其编码蛋白的详细特征;检索EST数据库,分析葡萄KEA家族基因的表达谱;利用实时荧光定量PCR分析KEA家族基因在葡萄不同组织部位的表达模式及对缺钾、ABA、NaCl与sorbitol等胁迫的响应情况,明确主效基因。【结果】在葡萄基因组中检索并克隆获得4个KEA家族基因,命名为VvKEA1—VvKEA4,均含有典型的K/H交换结构域(K/H exchanger domain)和TrkA-N domain功能结构域,属于典型的植物K+/H+逆向转运体;9种不同植物的KEA家族蛋白在氨基酸水平具有33.10%的一致性,并可分为2个亚族(GroupⅠ和GroupⅡ),其中,葡萄VvKEA1和VvKEA2属于GroupⅠ,均含有7个Motif基序,而VvKEA3和VvKEA4属于GroupⅡ,只含有4个Motif基序;系统进化树表明葡萄VvKEA1、VvKEA2和VvKEA4成员分别与拟南芥AtKEA2、AtKEA3和AtKEA5紧密聚在一起,而葡萄VvKEA3则与梨PbrKEA5和苹果MdoKEA7紧密聚在一起,水稻、玉米、高粱和短柄草4种禾本科植物KEA家族成员更倾向于聚在一起,而木本植物白杨、苹果、梨KEA家族成员紧密聚在一起;葡萄KEA家族蛋白拥有相似的三级结构,主要定位于细胞质膜,均含有12—13个跨膜区,均为稳定蛋白,等电点pI均小于7.00,且只有VvKEA3具有信号肽;在葡萄VvKEA启动子区域鉴定到至少15种的顺式作用元件,主要包括胁迫响应、营养和发育、激素响应、昼夜规律等不同生命活动相关的调控元件;EST表达谱结果表明葡萄KEA家族基因在多种组织或器官中均有表达,在果实中的表达水平最高,其次是叶、种子、根和雌蕊;实时荧光定量PCR分析表明VvKEA3在8年生‘白罗莎里奥’葡萄树不同组织中的整体表达水平最高,在幼果中的表达量最为突出,而其他3个VvKEA的整体表达水平相对较低,且较为接近;幼苗中,VvKEA1—VvKEA4在转录水平对NaCl处理没有响应,但对ABA处理最为敏感,VvKEA1—VvKEA4的表达量在检测幼苗的地上部和根部均被显著诱导,VvKEA3在检测幼苗的地上部和根部及VvKEA1在地上部的表达量受缺钾处理诱导而显著增强,VvKEA3在检测幼苗的地上部和根部及VvKEA4在根部的表达量受sorbitol渗透处理诱导而显著上升。【结论】从葡萄中克隆并鉴定了4个KEA家族基因,主要在葡萄果实、叶片和种子中表达,其成员与拟南芥KEA成员在遗传距离上较近;VvKEA3在成年葡萄树中的整体表达水平最为丰富(幼果中最高),幼苗中VvKEA3受缺钾、ABA和sorbitol渗透胁迫的调控;VvKEA3是葡萄果实中重要的K+/H+逆向转运体。

草莓KEA家族基因的克隆、鉴定及表达分析

K^+/H^+逆向转运体(KEA)介导细胞中K^+和H^+的动态平衡,在维持植物体内的离子平衡、生长发育和信号转导中起重要作用,然而,相关研究主要体现在模式作物拟南芥中,果树中KEA家族基因的功能依然未知。本研究以Yellow Wonder 5AF8草莓为材料,筛选并克隆KEA家族基因,并对其进行生物信息学鉴定和表达特征分析,为研究果树K^+/H^+平衡及钾素动态平衡机制提供基因资源和理论依据。结果表明,在草莓基因组中检索并克隆到5个KEA家族基因,命名为FveKEA1～FveKEA5,属于典型的植物K^+/H^+逆向转运体基因;编码的蛋白质与7种已报道的不同科属植物的KEA家族蛋白在氨基酸水平上具有25.00%的一致性,并可分为2个亚族(Group I和Group II),其中,草莓FveKEA1和FveKEA2属于Group I,只含有4个Motif基序,而FveKEA3～FveKEA5属于Group II,含有7个Motif基序;系统进化树表明草莓FveKEA2和FveKEA4分别与葡萄VvKEA2和苹果MdoKEA6紧密聚在一起,草莓FveKEA1、FveKEA3和FveKEA5分别与葡萄VvKEA1、白杨PtrKEA4、桃PpeKEA4等相应成员在遗传距离上较近;草莓KEA家族蛋白主要定位于细胞质膜,均含有12～14个跨膜区,除FveKEA3外,均为稳定蛋白,且只有FveKEA5含有信号肽;转录表达谱分析结果揭示草莓KEA家族基因在多种组织或器官中均有表达,实时荧光定量PCR结果表明FveKEA1在5AF8草莓不同组织中的整体表达水平最高,在花瓣和未成熟果实中的表达量最为突出,其次是FveKEA4,而其他3个基因的整体表达水平相对较低。此外,在草莓KEA基因启动子区域鉴定到至少16种顺式作用元件,且均含有光感应、胚乳表达和脱落酸(ABA)响应的作用元件。

栝楼桂枝汤通过调节脊髓NMDA受体/KCC2通路改善脑缺血再灌注大鼠肢体功能

目的探讨栝楼桂枝汤通过调节脊髓N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体/K^(+)-Cl^(-)共转运体(KCC2)通路改善脑缺血再灌注大鼠肢体功能的作用。方法采用线栓法制备SD大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型,依据神经行为学评分随机分为假手术组、模型组及栝楼桂枝汤组,每组12只。栝楼桂枝汤组给予对应汤剂治疗,其他组则给予生理盐水,每日1次,连续7 d。采用改良型神经缺损等级评分(mNSS)、平衡木测试(BBT)评价神经功能恢复状况。于造模后第7天采用免疫组织化学方法检测脊髓前角神经细胞兴奋性标志物c-fos、KCC2及NMDA受体各亚型(NMDAR1、NMDAR2A、NMDAR2B)的表达情况;采用qRT-PCR检测NMDA受体各亚型以及KCC2 mRNA的表达情况。结果与模型组比较,栝楼桂枝汤组可显著降低脑缺血损伤大鼠的mNSS评分(P<0.05)和BBT评分(P<0.01),改善大鼠肢体功能;免疫组织化学染色结果显示,栝楼桂枝汤可使脑缺血损伤大鼠脊髓运动神经细胞兴奋性标记物c-fos的表达显著降低(P<0.01),KCC2表达显著提升(P<0.01),NMDA受体各亚型的表达显著降低(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,栝楼桂枝汤可使脑缺血损伤大鼠脊髓NMDA受体各亚型mRNA表达显著降低(P<0.01),KCC2 mRNA表达显著升高(P<0.01)。结论栝楼桂枝汤可促进脑缺血再灌注损伤大鼠的肢体功能恢复,且可降低脑缺血所致的脊髓运动神经细胞的兴奋性,该作用可能与该方剂调节脊髓NMDA受体/KCC2通路有关。

刺五加总黄酮对新生缺血缺氧性脑损伤大鼠脑组织保护作用的研究

目的探讨刺五加总黄酮(TFAS)对新生缺血缺氧性脑损伤(HIBD)大鼠脑组织的保护作用。方法用结扎左侧颈总动脉法建立新生HIBD大鼠模型,并随机分为模型组和实验组,每组10只;另取10只新生大鼠只分离左侧颈总动脉,但不结扎颈作为假手术组。假手术组和模型组均给予腹腔注射0.9%NaCl 0.5 mL,qd;实验组给予腹腔注射5 mg·mL^-1TFAS溶液0.5 mL,qd。3组大鼠均连续用药7 d。用酶联免疫吸附实验法检测血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)水平,用实时荧光定量聚合酶链反应法和免疫组织荧光法分别检测脑组织中组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)和K^+-Cl^-共转运体2(KCC2)mRNA及蛋白的表达水平。结果实验组、假手术组和模型组的TNF-α分别为(67.04±5.12),(30.12±4.03)和(100.12±4.03)μg·L^-1,NGF分别为(16.43±2.56),(22.05±3.37)和(8.67±1.03)μg·L^-1,BDNF分别为(14.96±1.85),(20.67±2.46)和(6.59±1.15)μg·L^-1,HDAC1 mRNA表达水平分别为(1.21±0.19),(1.92±0.24)和(1.00±0.09),KCC2 mRNA表达水平分别为(0.73±0.12),(0.47±0.09)和(1.00±0.11),HDAC1蛋白表达水平分别为(0.91±0.17),(0.74±0.15)和(1.46±0.21),KCC2蛋白表达水平分别为(1.37±0.19),(1.53±0.24)和(0.82±0.13),实验组的上述指标与假手术组和模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);假手术组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论TFAS可明显抑制新生HIBD大鼠TNF-α的表达水平,提高NGF和BDNF的表达水平,从而达到保护HIBD大鼠脑组织的作用,其机制可能与调控HDAC1和KCC2 mRNA和蛋白表达有关。

酸枣仁-延胡索配伍对肝郁型失眠小鼠的作用及机制研究

目的探讨酸枣仁-延胡索配伍对肝郁型失眠小鼠的镇静催眠作用及机制。方法(1)将96只昆明小鼠随机分为4组:正常组、酸枣仁组(2.25 g·kg^(-1))、延胡索组(1.50 g·kg^(-1))、酸枣仁-延胡索配伍组(简称配伍组,3.75 g·kg^(-1)),每组24只;每日1次,连续灌胃10 d,然后观察戊巴比妥钠阈下剂量(腹腔注射,35 mg·kg^(-1))诱导小鼠的睡眠发生率,阈上剂量(腹腔注射,45 mg·kg^(-1))诱导小鼠的睡眠潜伏期、睡眠时间。(2)将60只昆明小鼠随机分为5组:正常组、模型组、酸枣仁组(2.25 g·kg^(-1))、延胡索组(1.50 g·kg^(-1))、配伍组(3.75 g·kg^(-1)),每组12只。采用慢性夹尾刺激和对氯苯丙氨酸(PCPA,400 mg·kg^(-1))腹腔注射的复合因子造模法复制肝郁型失眠小鼠模型。每日1次,连续灌胃给药14 d。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羟色胺(5-HT)的含量,检测垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)及下丘脑促肾上腺皮质激素释放素(CRH)的含量;采用免疫组化法检测垂体ACTH和海马5-HT的蛋白表达;采用q RT-PCR法检测脑组织中K^(+)-Cl^(-)共转运体2(KCC2)、Na^(+),K^(+)-2Cl^(-)共转运体1(NKCC1)m RNA表达水平。结果(1)与正常组比较,给药组小鼠的睡眠发生率明显提高,睡眠时间显著延长(P<0.01);酸枣仁组及配伍组的睡眠潜伏期显著缩短(P<0.01)。(2)与正常组比较,模型组小鼠血清的NE、DA含量明显升高(P<0.05,P<0.01),5-HT含量明显降低(P<0.01);脑垂体ACTH及下丘脑CRH含量明显升高(P<0.01);垂体中ACTH的表达明显上调(P<0.01),海马中5-HT的表达明显下调(P<0.01);脑组织的KCC2 m RNA表达明显下调(P<0.01),NKCC1 m RNA表达明显上调(P<0.01)。与模型组比较,配伍组小鼠血清的NE、DA含量明显降低(P<0.01),5-HT含量明显升高(P<0.01);脑垂体ACTH及下丘脑CRH含量明显降低(P<0.01);脑垂体中ACTH的表达明显下调(P<0.01),海马中5-HT的表达明显上调(P<0.01);脑组织的KCC2 m RNA表达明显上调(P<0.01),NKCC1 m RNA表达明显下调(P<0.05)。结论酸枣仁-延胡索配伍对肝郁型失眠小鼠具有镇静催眠作用,可能与其调控KCC2、NKCC1基因表达,抑制HPA轴激活,从而调节神经递质水平有关。