卵巢癌中k-ras基因点突变及p53蛋白表达

目的 探讨k-ras基因点突变和p53蛋白表达在卵巢癌发生中的作用及致癌机制。方法 采用显微切割技术、半巢 式PCR RFLP技术和免疫组化染色检测55例卵巢癌及其交界性病变中的k-ras基因点突变和p53蛋白表达。结果 k ras基 因点突变率在黏液性腺癌(61.9%)明显高于浆液性腺癌(14.2%),在黏液性交界性腺瘤(61.5%)明显高于浆液性交界性腺 瘤(12.5%)。p53蛋白表达率在浆液性腺癌(80%)明显高于黏液性腺癌(52%),并随组织学分级而增高。结论 黏液性腺 癌主要通过腺瘤-交界性腺瘤-腺癌途径致癌,k-ras基因点突变是黏液性腺癌的早期事件,黏液性交界性腺瘤是黏液性腺癌 的癌前病变。浆液性腺癌主要通过生发上皮直接恶性转化形成,p53蛋白表达在浆液性腺癌的发生中起重要作用,是浆液性 腺癌的晚期事件。

西妥昔单抗联合FOLFIRI双周方案在野生型K-Ras基因晚期结直肠癌患者中的Ⅱ期临床观察

目的探讨西妥昔单抗联合FOLFIRI双周方案治疗K-Ras基因野生型的晚期结直肠癌的疗效及安全性。方法收集2008年1月至2010年6月44例K-Ras基因野生型的晚期结直肠癌患者,采用西妥昔单抗联合FOLFIRI双周方案进行治疗。具体方案:西妥昔单抗500mg/m2静滴,2周1次;伊立替康180mg/m2静滴30～90min,d1;亚叶酸钙200mg/m2静滴2h,d1;氟尿嘧啶(5-FU)400mg/m2静推,d1;5-FU 2400mg/m2持续静滴46h。14天为1周期。每例患者至少接受4个周期化疗后评价疗效。不良反应按照NCI CTC 3.0标准评价。结果全组44例患者均可评价疗效,获CR 2例(4.6%),PR 22例(50.0%),SD 17例(38.6%),PD 3例(6.8%);有效率为54.6%,疾病控制率为93.2%。单因素分析显示,有效率与肿瘤原发部位有关,与性别、年龄、转移脏器个数、转移部位和ECOG评分无关,疾病控制率与临床病理特征均无关;Logistic多因素回归分析显示,原发部位是影响疗效的独立因素(P=0.0455)。44例患者的中位总生存时间(OS)为25.7个月(95%CI:20.5～34.6个月),中位无进展生存时间(PFS)为8.4个月(95%CI:6.3～11.7个月)。Cox多因素分析显示,ECOG评分为影响PFS的独立因素,而性别为影响OS的独立因素。毒副反应主要为皮疹、中性粒细胞减少和消化道反应,以1～2级为主。结论西妥昔单抗联合FOLFIRI双周方案治疗晚期结直肠癌疗效肯定,毒副反应可以耐受,值得临床推广。

PCR-SSP法和基因测序检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变及其方式

目的检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因点突变及其突变方式,明确基因治疗靶点的碱基序列。方法针对K-ras基因第12位密码子点突变方式(CGT、GTT、GAT)设计顺序特异性引物(SSP),对人胰腺癌细胞株Patu 8988进行聚合酶链反应(PCR),扩增产物经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后判断该细胞株有无K-ras基因点突变及其突变方式。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因,扩增产物直接进行基因序列测定。结果PCR-SSP法检测人胰腺癌细胞株Patu 8988存在K-ras基因点突变,突变方式为GGT→GTT,其结果与基因序列测定完全相符。结论明确了人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变方式(GGT→GTT),为胰腺癌的下一步基因治疗研究打下了坚实的基础;PCR-SSP方法检测K-ras基因点突变简便、快速、经济且特异性高,有望在临床上成为早期诊断和鉴别诊断胰腺癌的实用检测方法。

长期吸烟对大鼠肺组织p53、K-ras蛋白表达和基因突变的影响

目的观察长期吸烟对Wistar大鼠肺组织p53、K-ras表达的影响,研究吸烟与肺组织p53、K-ras基因突变的关系。方法建立Wistar大鼠被动吸烟模型。72只雄性Wistar大鼠分为实验组和对照组,实验组被动吸烟6个月,对照组正常呼吸条件下饲养,每个月末分别取6只大鼠肺组织,免疫组织化学观察p53和K-ras蛋白表达情况,聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测p53第5、6、7～8外显子和K-ras第1外显子的突变情况。结果免疫组织化学结果显示,p53蛋白表达于细胞核,K-ras蛋白表达于胞浆,吸烟组p53、K-ras蛋白表达强度与正常组比较有显著性差异。随着吸烟时间的增加,p53、K-ras蛋白阳性表达率均随吸烟时间的延长而升高。PCR-SSCP显示,p53基因随吸烟时间的延长突变率增加;K-ras基因突变率随吸烟时间延长增加不显著。结论吸烟可以导致大鼠肺组织p53、K-ras蛋白表达增强和基因突变率增加,随吸烟时间的延长呈上升趋势,为吸烟对肺的组织基因突变的判定及吸烟者肺癌的早期诊断提供理论依据,具有重要的理论和应用价值。

小分子干扰RNA特异性抑制人胰腺癌细胞株PANC-1突变型K-ras基因表达的探讨

目的:研究小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)对人胰腺癌细胞株PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用。方法:构建真核表达载体pSilencer3.1-K-rasv12,转染PANC-1细胞后应用RT-PCR及Westernblot检测突变型K-ras基因mRNA及蛋白质表达变化;噻唑蓝(MTT)测定细胞生长曲线;流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:测序证实siRNA真核表达载体构建成功。RT-PCR光密度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:95.3%±2.5%、97.6%±2.8%、40.1%±3.1%,差异有统计学意义(P<0.05);Westernblot灰度比值结果空载体组、阴性对照组、实验组分别为:96.1%±2.2%、98.5%±2.0%、36.5%±3.2%,差异有统计学意义(P<0.05);实验组细胞生长受到明显抑制,凋亡率较对照组明显升高(P<0.05)。结论:pSilencer3.1-K-rasv12能有效抑制突变型K-ras基因在人胰腺癌细胞株PANC-1中的表达,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡,为肿瘤的生物学治疗提供了新的方法。

散发性大肠癌K-ras基因点突变研究及其临床病理意义

目的观察散性大肠癌K—ras基因12、13密码子点突变情况，探讨其与临床病理特征的关系。方法对2005～2009年问浙江省肿瘤医院确诊的140例大肠痛进行回顾性分析，并提取石蜡标本中癌组织DNA，经PCR扩增后应用焦磷酸测序技术检测K—ras基因第12、13密码子点突变情况。结果K—ras基因突变率397％（55／140），12密码子突变率78．2％（43／55），13密码子突变率21．8％（12／55）。共发现7种突变类型，包括12密码子（GGT→AT、GGT→AGT、GGT→TGT、GGT-→GTT、GGT→CGT、GGT→GCT）和13密码子（GGC→GAC），以12密码子（CGT→GAT）最常见，占突变总数41．8％（23／55）。K—ras基因突变与性别、年龄、大体类型、瘤体、原发部位、病理亚型、组织学分级、浸润深度、转移、Duke’S分期、脉管侵犯均无相关性（P〉0．05）；第12与13密码子突变在原发部位、淋巴结转移上差异有统计学意义（P〈0．05）。结论散发性大肠癌中K—ras基因突变率为39．7％，12密码子（GGT→GAT）突变是最常见类型。特定位点的突变与一些临床病理参数密切相关，其中12密码子突变在结肠癌中的发生率高，并易出现淋巴结转移。通过K—ras基因检测有助于指导临床开展大肠癌个体化治疗。

逆转录病毒载体介导反义K-ras基因治疗胰腺癌的实验研究

目的:分离及克隆胰腺癌细胞基因组中K-ras基因片段,构建含反义K-ras癌基因逆转录病毒载体并探讨其对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响及可能的分子机制. 方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI 和EcoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3、PC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1、4及侧翼序列,将目的基因克隆入逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒,经PT-67细胞包装后获得重组逆转录病毒.将该重组逆转录病毒转染上述细胞,经G418筛选获得稳定细胞,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增生、凋亡和对胰腺癌p21蛋白表达;建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,观察反义K-ras基因体内治疗效果. 结果:成功构建含反义K-ras基因的重组逆转录病毒载体.反义K-ras基因抑制胰腺癌细胞增生,诱导细胞凋亡、下调K-rasmRNA和P21蛋白表达,并抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长. 结论:反义K-ras基因可使胰腺癌细胞增生受到抑制,并可诱导细胞凋亡和下调K-rasmRNA和P21蛋白表达.

突变K-ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响

目的:构建含12密码子点突变的K-ras基因siRNA腺病毒载体,并研究其对人肺腺癌细胞株H441中突变K-ras基因表达的影响。方法:首先构建含有K-rasV12 siRNA的人H1启动子真核表达载体pSilencerH1/siK-rasV12;利用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切将人H1载体启动子和K-rasV12 siRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,形成转移质粒pAdTrack-H1/siK-rasV12,然后与腺病毒骨架质粒pAd/PL共转染至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切、序列鉴定。提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒AdH1/siK-rasV12,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染人肺腺癌H441细胞株,采用Westernblot检测感染前后K-rasV12蛋白表达水平的变化,观察AdH1/siK-rasV12对人肺腺癌细胞K-rasV12表达的影响。结果:成功构建K-rasV12s iRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制H441细胞中K-rasV12蛋白的表达。结论:构建的AdH1/siK-rasV12腺病毒能有效抑制突变K-ras基因在人肺腺癌细胞株H441中的表达,为肺癌的基因治疗提供了新的方法和材料。

吸烟与肺癌p53及K-ras基因突变关系的研究进展

p53和K ras基因突变常见于肺癌,吸烟是引起p53和K ras基因突变的主要危险因素。吸烟 相关性肺癌基因突变以G→T为主,这在其它肿瘤及不吸烟者肺癌很少见。p53基因突变常发生于第157、 156、245、248、273密码子,K ras基因突变常发生于第12密码子,他们都是烟草致癌物的强结合位点。对吸烟 与p53、K ras基因突变关系的研究,在临床早期诊断及判断预后等方面均有应用价值。

K—ras基因与结直肠癌疗效

K—ras基因是一种癌基因，促进细胞生长、分化，基因的突变使ras蛋白丧失GTP酶活性，导致细胞的异常生长、分化，促进癌的发生，同时导致使用抗表皮生长因子受体（EGFR）多克隆抗体药物治疗的结直肠癌患者无明显获益。结直肠癌不同实体肿瘤的K—ras基因突变率不同，K—ras基因野生型或突变型对治疗方案选择及预后具有重要意义，突变型患者使用抗EGFR抗体治疗效果差，对5-Fu、FOLFOX疗效尚无一致定论。

K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌靶基因表达的抑制作用

目的 观察针对于胰腺癌K ras基因点突变的反义寡核苷酸对靶基因表达的抑制作用。方法 脂质体将人工合成的针对于K ras基因第 12位密码子点突变的反义寡核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC 2 ,用免疫组化和原位杂交技术检测靶基因的表达。结果 转染 4 8h后 ,反义寡核苷酸作用组胰腺癌细胞株PC 2的ras蛋白和K rasmRNA的表达程度较正义组和对照组均明显降低 (P <0 .0 5 )。结论 针对于K ras基因点突变的反义寡核苷酸作用于体外培养的胰腺癌细胞 。

应用寡核苷酸芯片检测白血病患者P53和K-ras基因点突变

目的 研究白血病病例中P5 3、K ras基因点突变情况。方法 采用寡核苷酸芯片技术对临床收集的白血病标本进行P5 3、K ras突变热点检测。结果 共检测出P5 3突变 8例、K RAS突变 4例。其中P5 3突变包括ANLL M 32例 ,M2 3例 ,AN LL M 5、ALL、CML各 1例。K ras突变包括CML3例 ,ALL1例。结论 P5 3、K ras突变在白血病发生、发展中起到一定作用。应用寡核苷酸芯片进行P5 3、K ras点突变检测 ,优缺点并存 。

人突变K-ras基因修饰lewis肺癌细胞株的建立及其生物学特性

目的:探讨以K-ras基因为靶点,建立人K-ras(12位密码子点突变)基因修饰的lewis肺癌细胞株3LL-pcDNA3-K-ras/V12及其生物学特性。方法:应用脂质体法将人K-ras(12位密码子点突变)基因cDNA导入lewis肺癌细胞株3LL,应用流式细胞仪检测p21/V12蛋白的表达,同时检测3LL细胞株转基因前后生长、克隆形成率和体内成瘤的变化。结果:成功的将人K-ras(12位密码子点突变)基因cDNA导入lewis肺癌细胞株3LL,p21/V12蛋白在3LL-pcDNA3-K-ras/V12中稳定表达,转基因细胞株的生长曲线和克隆形成率与原代细胞株3LL无显著差异;但转基因细胞株在C57BL/6小鼠体内的成瘤性显著高于原代细胞株3LL。结论:成功的建立了导入K-ras(12位密码子点突变)的lewis肺癌细胞株3LL-pcDNA3-K-ras/V12。

人粪便K-ras基因扩增检测对大肠癌诊断和术后随诊的意义探讨

目的了解大肠癌组织及粪便中K-ras基因的突变状况,了解粪便中脱落细胞基因检测的可行性及其临床意义。方法采用PCR-RFLP银染色法检测30例大肠癌患者的手术标本和粪便脱落细胞的K-ras基因第12密码子的突变状况。结果K-ras第12密码子突变检出敏感性癌组织为70%(21/30),粪便为60%(18/30)。粪便与相应患者的癌组织检测符合率为90%(27/30)。结论K-ras基因突变是大肠癌常见的分子事件,粪便中基因突变检测结果较准确地反映了癌组织突变状况,对其检测有望成为大肠癌诊断及筛查的无创分子途径。

K-ras基因与结直肠腺癌关系研究进展

肿瘤的发生涉及癌基因的激活及抑癌基因的失活,K-ras基因是与肿瘤形成关系较为密切的一种癌基因,其功能异常能够影响细胞的生长、增殖、分化和凋亡等。研究已发现K-ras基因的突变激活是结直肠癌变过程中的重要事件之一。本文拟对K-ras基因的生物学特性、对细胞信号转导的影响及在结直肠腺癌形成与治疗中的作用作一综述。

子宫内膜癌与K-ras基因突变的研究

目的：分析子宫内膜癌组织中K-ras基因突变状况及其与Ras蛋白表达的相关性，从基因水平探讨K-ras基因在子宫内膜癌发病中的作用机制。方法：诊断明确的子宫内膜癌手术切除标本108例及同期因其他病因行刮宫术的正常子宫内膜。应用免疫组织化学染色法检测K-ras的表达，PCR扩增一直接测序法检测K-ras基因第2外显子12、13密码子突变，分析K-ras基因突变对Ras蛋白表达的影响及临床意义。结果：K—ras蛋白阳性表达率在子宫内膜癌明显高于正常子宫内膜；子宫内膜癌中K-ras基因突变率为33．3％；其中第12位密码子突变占75．0％，突变位点均位于K-ras基因第12位密码子第2位碱基上；第13位密码子突变率为25％，突变位点位于K-ras基因第13位密码子第1、2位碱基上。K-ras基因突变与Ras蛋白表达成正相关。结论：K—ras蛋白的阳性表达率可能是预示子宫内膜癌预后的一个因素，K—ras基因12密码子G—T和G—A突变是主要的突变方式。12密码子的突变可能为Ras蛋白增多的原因。

硫酸镍诱导16HBE细胞恶变过程中的K-ras、P15基因的改变及基因组不稳定性分析

目的 检测硫酸镍对K—ras基因和P15基因的改变及基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析方法探查硫酸镍在诱导16HBE细胞恶变过程中的K—ras基因Exon1和P15基因Exon2存在状况。采用随机扩增多态性技术对硫酸镍在诱导16HBE细胞恶变过程中的基因组不稳定性进行分析。结果 K—ras基因Exon1和P15基因Exon2未发生改变。本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带，条带数在1～6条之间。7条引物中P1、P4、P7三条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余四条引物均有差异，对于同一随机引物他们都具有特异的带型。结论 P15基因第2外显子和K—ras琏因第一外显子可能不足硫酸镍作用的靶部位。在硫酸镍诱发细胞恶变转化过程中，基因组变得逐渐不稳定。

应用ADx-ARMS法对大肠癌组织中K-ras基因突变的检测

目的探讨ADx-ARMS法对大肠癌组织中K-ras基因突变的检测情况。方法选择首都医科大学附属北京世纪坛医院2012年4～8月的大肠癌石蜡标本40例。应用ADx-ARMS法检测大肠癌石蜡标本中的K-ras基因7个热点突变,分析与年龄、性别、组织学分型以及病理分化程度的关系。结果 40例大肠癌样本中共发现K-ras基因突变14例,突变率约为35.0%。K-ras基因突变与年龄及组织学分型无关(P>0.05),与患者性别(P<0.05)及腺癌分化程度(P<0.01)有关。结论 ADx-ARMS法检测大肠癌组织中K-ras基因突变效果满意,值得临床应用。

胰腺癌切除前后胰液K-ras基因点突变率变化的研究

对13例胰腺癌行胰十二指肠切除前后的胰液标本采用PCR－SSP检测K－ras基因有无穷变。结果发现：切除前胰液K－ras基因点突变率为100％，切除后第3日、第7日及第15日的胰液K－ras基因点突变率分别为15．4％（2／13）、0、0.研究表明：术前对收集的胰液行PCR－SSP检测K－ras有无穷变，有助于判断胰腺肿块的良恶性和胰腺癌的诊断，术后定期检测胶液，有助于及时发现多中心或复发病例，指导治疗，有利于康复。