胰腺癌切除前后胰液K-ras基因点突变率变化的研究

对13例胰腺癌行胰十二指肠切除前后的胰液标本采用PCR－SSP检测K－ras基因有无穷变。结果发现：切除前胰液K－ras基因点突变率为100％，切除后第3日、第7日及第15日的胰液K－ras基因点突变率分别为15．4％（2／13）、0、0.研究表明：术前对收集的胰液行PCR－SSP检测K－ras有无穷变，有助于判断胰腺肿块的良恶性和胰腺癌的诊断，术后定期检测胶液，有助于及时发现多中心或复发病例，指导治疗，有利于康复。

卵巢癌中k-ras基因点突变及p53蛋白表达

目的 探讨k-ras基因点突变和p53蛋白表达在卵巢癌发生中的作用及致癌机制。方法 采用显微切割技术、半巢 式PCR RFLP技术和免疫组化染色检测55例卵巢癌及其交界性病变中的k-ras基因点突变和p53蛋白表达。结果 k ras基 因点突变率在黏液性腺癌(61.9%)明显高于浆液性腺癌(14.2%),在黏液性交界性腺瘤(61.5%)明显高于浆液性交界性腺 瘤(12.5%)。p53蛋白表达率在浆液性腺癌(80%)明显高于黏液性腺癌(52%),并随组织学分级而增高。结论 黏液性腺 癌主要通过腺瘤-交界性腺瘤-腺癌途径致癌,k-ras基因点突变是黏液性腺癌的早期事件,黏液性交界性腺瘤是黏液性腺癌 的癌前病变。浆液性腺癌主要通过生发上皮直接恶性转化形成,p53蛋白表达在浆液性腺癌的发生中起重要作用,是浆液性 腺癌的晚期事件。

PCR-SSP法和基因测序检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变及其方式

目的检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因点突变及其突变方式,明确基因治疗靶点的碱基序列。方法针对K-ras基因第12位密码子点突变方式(CGT、GTT、GAT)设计顺序特异性引物(SSP),对人胰腺癌细胞株Patu 8988进行聚合酶链反应(PCR),扩增产物经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后判断该细胞株有无K-ras基因点突变及其突变方式。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因,扩增产物直接进行基因序列测定。结果PCR-SSP法检测人胰腺癌细胞株Patu 8988存在K-ras基因点突变,突变方式为GGT→GTT,其结果与基因序列测定完全相符。结论明确了人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变方式(GGT→GTT),为胰腺癌的下一步基因治疗研究打下了坚实的基础;PCR-SSP方法检测K-ras基因点突变简便、快速、经济且特异性高,有望在临床上成为早期诊断和鉴别诊断胰腺癌的实用检测方法。

应用焦磷酸测序法检测进展期结直肠癌中K-ras基因点突变

目的建立基于焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)的结直肠癌K-ras基因点突变的检测方法,并应用于进展期结直肠癌及其转移灶中K-ras基因突变的检测。方法提取116例Ⅳ期结直肠癌及11例转移灶中的DNA,进行PCR扩增后应用Pyrosequencing法检测K-ras基因12及13密码子点突变。结果 116例Ⅳ期结直肠癌中有29例检出K-ras基因点突变,突变率为25.0%,在所有29例突变病例中12密码子点突变率为82.8%(24/29),13密码子点突变率为17.2%(5/29),所有11例转移灶的K-ras基因均与其原发病灶相一致。结论 Pyrosequencing能准确、快速、高通量地进行K-ras基因点突变测定,适合大规模临床标本检测,有利于指导结直肠癌尤其是转移性病变的个体化治疗。

散发性大肠癌K-ras基因点突变研究及其临床病理意义

目的观察散性大肠癌K—ras基因12、13密码子点突变情况，探讨其与临床病理特征的关系。方法对2005～2009年问浙江省肿瘤医院确诊的140例大肠痛进行回顾性分析，并提取石蜡标本中癌组织DNA，经PCR扩增后应用焦磷酸测序技术检测K—ras基因第12、13密码子点突变情况。结果K—ras基因突变率397％（55／140），12密码子突变率78．2％（43／55），13密码子突变率21．8％（12／55）。共发现7种突变类型，包括12密码子（GGT→AT、GGT→AGT、GGT→TGT、GGT-→GTT、GGT→CGT、GGT→GCT）和13密码子（GGC→GAC），以12密码子（CGT→GAT）最常见，占突变总数41．8％（23／55）。K—ras基因突变与性别、年龄、大体类型、瘤体、原发部位、病理亚型、组织学分级、浸润深度、转移、Duke’S分期、脉管侵犯均无相关性（P〉0．05）；第12与13密码子突变在原发部位、淋巴结转移上差异有统计学意义（P〈0．05）。结论散发性大肠癌中K—ras基因突变率为39．7％，12密码子（GGT→GAT）突变是最常见类型。特定位点的突变与一些临床病理参数密切相关，其中12密码子突变在结肠癌中的发生率高，并易出现淋巴结转移。通过K—ras基因检测有助于指导临床开展大肠癌个体化治疗。

胰腺癌组织c-Ki-ras基因点突变分析

目的研究14例胰腺癌的c-K-ras基因的点突变。方法采用PCR和DNA直接测序方法(direct sequencingmethod)分析14例胰腺癌的福尔马林固定—石蜡包埋的癌组织。结果在14例胰腺癌组织中,12例有c-k-ras基因的点突变,突变发生率为86％.点突变发生在第12,13位密码子,点突变的形式为甘氨酸(GGT)→天冬氨酸(GAT)8例→缬氨酸(GTT)3例→精氨酸(CGT)1例。结论胰腺癌ras基因点突变发生率高(86％),可为有争议胰腺癌病例的诊断提供一个可靠的新方法,并可为其基因治疗开辟新途径。

应用寡核苷酸芯片检测白血病患者P53和K-ras基因点突变

目的 研究白血病病例中P5 3、K ras基因点突变情况。方法 采用寡核苷酸芯片技术对临床收集的白血病标本进行P5 3、K ras突变热点检测。结果 共检测出P5 3突变 8例、K RAS突变 4例。其中P5 3突变包括ANLL M 32例 ,M2 3例 ,AN LL M 5、ALL、CML各 1例。K ras突变包括CML3例 ,ALL1例。结论 P5 3、K ras突变在白血病发生、发展中起到一定作用。应用寡核苷酸芯片进行P5 3、K ras点突变检测 ,优缺点并存 。

K-ras基因点突变的反义寡脱氧核苷酸对人胰腺癌靶基因表达的抑制作用

目的 观察针对于胰腺癌K ras基因点突变的反义寡核苷酸对靶基因表达的抑制作用。方法 脂质体将人工合成的针对于K ras基因第 12位密码子点突变的反义寡核苷酸转染体外培养的人胰腺癌细胞株PC 2 ,用免疫组化和原位杂交技术检测靶基因的表达。结果 转染 4 8h后 ,反义寡核苷酸作用组胰腺癌细胞株PC 2的ras蛋白和K rasmRNA的表达程度较正义组和对照组均明显降低 (P <0 .0 5 )。结论 针对于K ras基因点突变的反义寡核苷酸作用于体外培养的胰腺癌细胞 。

非小细胞肺癌K-ras基因点突变的研究

目的研究肿瘤组织中K-ras基因点突变在非小细胞肺癌(NSCLC)发生中的作用。方法采用聚合酶链反应—单链构象多态性结合银染技术检测31例NSCLC患者肿瘤组织标本中K-ras基因第12、13、61位密码子的突变情况。结果肺癌组织中K-ras突变率与癌旁正常对照组织比较有显著差异(P<0.01);K-ras基因突变与NSCLC患者年龄、性别、吸烟与否、临床分期及肿瘤细胞分化程度无关,但与病理组织学类型相关。结论K-ras基因突变参与了NSCLC的发病过程,可能是NSCLC发生的早期事件。

错配碱基PCR-RFLP检测K-ras癌基因点突变

错配碱基套式PCR RFLP检测K ras癌基因第 1 2位密码子点突变 ,并与一步法PCR RFLP作比较 .结果显示套式PCR RFLP可检测出 50 0细胞中的一个突变细胞 ,比一步法PCR RFLP分析的敏感性提高了 1 0 0倍 .利用该方法检测纤维支气管镜收集的标本中的突变细胞 ,结果发现 9例肺腺癌中有 5例发生了K ras癌基因第 1 2位密码子点突变 .提示该方法可行 ,值得推广应用 .

直肠癌患者中K-ras基因12位点突变及p21蛋白表达的研究

目的 检测K-ras基因12位点突变和p21蛋白表达在直肠癌中的作用,并探讨K-ras基因12位点突变、p21蛋白表达与临床、病理参数之间的关系.方法 收集52例直肠癌手术标本,应用常规方法提取直肠癌组织和相应癌周正常组织的DNA、聚合酶链反应（PCR）扩增、单链构象多态性（SSCP）电泳,检测K-ras基因12位点的突变情况,用免疫组织化学方法检测p21蛋白的表达.结果 直肠癌发生K-ras基因12位点突变为44.2%,相应癌周正常组织中未检出K-ras基因12位点突变,差异有统计学意义（P＜0.01）.p21蛋白表达率为63.46%,明显高于相应癌周正常组织的表达率,差异有统计学意义（P＜0.01）.K-ras基因突变与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、组织学类型、淋巴结转移、远处转移无关.p21蛋白高表达与淋巴结转移密切相关（P＜0.01）,与远处转移有关（P＜0.05）,与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、组织学类型无关（P＞0.05）.结论 K-ras基因12位点的突变是直肠癌发生的重要事件,可作为一种诊断标志物.p21蛋白表达与直肠癌发生密切相关,可作为一种免疫标志物,并可用于判断直肠癌的预后.

改良法对NSCLC患者癌组织及外周血K-ras基因常见突变位点的检测

目的建立改良的酶切富集PCR-焦磷酸测序技术,检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者癌组织与血浆中K-ras基因的突变情况。方法配对提取43例NSCLC患者的癌组织和血浆DNA,采用酶切富集PCR-焦磷酸测序技术检测K-ras基因第2外显子12及13密码子点突变,利用混合突变/野生型K-ras基因的细胞系(A549/HCC827)测定该方法的灵敏度。结果 NSCLC患者癌组织中K-ras突变率为9.3%(4/43),血浆中K-ras突变率为7.0%(3/43),均为12密码子突变,突变一致性达75%。混合细胞系检测显示,酶切富集PCR-焦磷酸测序技术的检测灵敏度达0.1%。结论酶切富集PCR-焦磷酸测序技术具有快速、准确、灵敏度高等优点,可用于临床NSCLC患者K-ras突变的筛查。

中药健脾康复方对大肠癌脾虚证患者K-ras和p53基因突变的抑制作用

目的:研究中药健脾康复方对大肠癌脾虚证患者K-ras和p53基因突变的抑制作用. 方法:选择中晚期大肠癌患者45例,随机分为治疗组和对照组.治疗组30例,在对症支持治疗的基础上口服健脾康复方,每日1剂,对照组15例,只给予对症支持治疗, 疗程为2 mo.观察治疗前后外周血K-ras基因突变率和血清突变型p53基因蛋白含量的变化. 结果:治疗组患者外周血K-ras基因突变率治疗后为26.7% (8/30),较治疗前的73.3%(22/30)显著下降(P<0.05);治疗组患者血清突变型p53基因蛋白含量治疗后(0.82±0.24 ng/L) 较治疗前(0.89±0.21ng/L)显著下降(t=2.34,P<0.05). 对照组以上两项指标治疗前后差异无显著意义. 结论:中药健脾康复方具有抑制K-ras和p53基因突变的作用.

采用PCR—RFLP技术分析石蜡包埋胃癌组织ras和p53基因点突变

采用多聚酶链延伸反应一限制性片段长度多态性分析（ＰＣＲ—ＲＦＬＰ）法对福尔马林固定、石蜡包埋胃癌组织ｒａｓ和ｐ５３基因点突变进行分析，结果表明，Ｃ—Ｈａ—ｒａｓ第１２位密码子突变率为１３．６％（１２／８８），第６１位密码子为３．８％（３／８０）；Ｃ—Ｋｉ—ｒａｓ第１２位密码子点突变率为７．２％（５／６９），第１３位密码子未发现有点突变者；Ｎ—ｒａｓ第１２位密码子点突变率为１．４％（１／６８）。ｐ５３基因第２４８位密码子点突变率为７．４％（５／６８），第２４９位密码子未见有点突变者。以上提示采用ＰＣＲ—ＲＦＬＰ技术可对多数从石蜡包埋胃癌组织提取的ＤＮＡ进行ｒａｓ和ｐ５３基因点突变分析。

电化学发光PCR定量检测H-ras癌基因点突变

提出了一种电化学发光PCR(ECL-PCR)分析方法, 该法可用于定量检测基因点突变. 其检测H-ras癌基因PCR扩增产物的灵敏度可达100 fmol;线性范围为0.1～500 pmol. 用ECL-PCR分析法对膀胱癌组织中H-ras癌基因进行突变检测, 只需要10 μL样品, 20 min的孵育时间和30 s的采集时间, 得出20例膀胱癌样品中有7例存在点突变, 通过标准曲线方程定量计算出突变样品的量. ECL-PCR分析方法在灵敏度、线性范围、分析时间等方面都优于传统的检测方法, 是一种安全、快速、灵敏、定量检测基因点突变的分析方法.

连黛片对大鼠溃疡性胃癌ras基因点突变的影响

用醋酸注射法造成大鼠胃溃疡模型 ,再以MNNG灌胃诱发胃癌 ,观察连黛片对胃癌形成及对ras基因点突变的影响 ,结果表明 ,连黛片可减少MNNG对ras的甲基化 ,抑制ras点突变及过表达 ,降低溃疡性胃癌的发生率。

长期吸烟对大鼠肺组织p53、K-ras蛋白表达和基因突变的影响

目的观察长期吸烟对Wistar大鼠肺组织p53、K-ras表达的影响,研究吸烟与肺组织p53、K-ras基因突变的关系。方法建立Wistar大鼠被动吸烟模型。72只雄性Wistar大鼠分为实验组和对照组,实验组被动吸烟6个月,对照组正常呼吸条件下饲养,每个月末分别取6只大鼠肺组织,免疫组织化学观察p53和K-ras蛋白表达情况,聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测p53第5、6、7～8外显子和K-ras第1外显子的突变情况。结果免疫组织化学结果显示,p53蛋白表达于细胞核,K-ras蛋白表达于胞浆,吸烟组p53、K-ras蛋白表达强度与正常组比较有显著性差异。随着吸烟时间的增加,p53、K-ras蛋白阳性表达率均随吸烟时间的延长而升高。PCR-SSCP显示,p53基因随吸烟时间的延长突变率增加;K-ras基因突变率随吸烟时间延长增加不显著。结论吸烟可以导致大鼠肺组织p53、K-ras蛋白表达增强和基因突变率增加,随吸烟时间的延长呈上升趋势,为吸烟对肺的组织基因突变的判定及吸烟者肺癌的早期诊断提供理论依据,具有重要的理论和应用价值。

突变K-ras基因siRNA腺病毒载体的构建及其对人肺腺癌细胞株H441的影响

目的:构建含12密码子点突变的K-ras基因siRNA腺病毒载体,并研究其对人肺腺癌细胞株H441中突变K-ras基因表达的影响。方法:首先构建含有K-rasV12 siRNA的人H1启动子真核表达载体pSilencerH1/siK-rasV12;利用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切将人H1载体启动子和K-rasV12 siRNA序列亚克隆至经相同酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack中,形成转移质粒pAdTrack-H1/siK-rasV12,然后与腺病毒骨架质粒pAd/PL共转染至大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,酶切、序列鉴定。提取含目的基因的腺病毒重组体质粒,经PacⅠ酶切线性化后用脂质体转染293细胞,包装成重组腺病毒AdH1/siK-rasV12,扩增、纯化,并对病毒滴度进行检测。利用得到的重组腺病毒感染人肺腺癌H441细胞株,采用Westernblot检测感染前后K-rasV12蛋白表达水平的变化,观察AdH1/siK-rasV12对人肺腺癌细胞K-rasV12表达的影响。结果:成功构建K-rasV12s iRNA腺病毒载体,该载体可明显抑制H441细胞中K-rasV12蛋白的表达。结论:构建的AdH1/siK-rasV12腺病毒能有效抑制突变K-ras基因在人肺腺癌细胞株H441中的表达,为肺癌的基因治疗提供了新的方法和材料。

吸烟与肺癌p53及K-ras基因突变关系的研究进展

p53和K ras基因突变常见于肺癌,吸烟是引起p53和K ras基因突变的主要危险因素。吸烟 相关性肺癌基因突变以G→T为主,这在其它肿瘤及不吸烟者肺癌很少见。p53基因突变常发生于第157、 156、245、248、273密码子,K ras基因突变常发生于第12密码子,他们都是烟草致癌物的强结合位点。对吸烟 与p53、K ras基因突变关系的研究,在临床早期诊断及判断预后等方面均有应用价值。

人突变K-ras基因修饰lewis肺癌细胞株的建立及其生物学特性

目的:探讨以K-ras基因为靶点,建立人K-ras(12位密码子点突变)基因修饰的lewis肺癌细胞株3LL-pcDNA3-K-ras/V12及其生物学特性。方法:应用脂质体法将人K-ras(12位密码子点突变)基因cDNA导入lewis肺癌细胞株3LL,应用流式细胞仪检测p21/V12蛋白的表达,同时检测3LL细胞株转基因前后生长、克隆形成率和体内成瘤的变化。结果:成功的将人K-ras(12位密码子点突变)基因cDNA导入lewis肺癌细胞株3LL,p21/V12蛋白在3LL-pcDNA3-K-ras/V12中稳定表达,转基因细胞株的生长曲线和克隆形成率与原代细胞株3LL无显著差异;但转基因细胞株在C57BL/6小鼠体内的成瘤性显著高于原代细胞株3LL。结论:成功的建立了导入K-ras(12位密码子点突变)的lewis肺癌细胞株3LL-pcDNA3-K-ras/V12。