带瘤小鼠NK与K细胞功能的研究

多数学者认为,NK细胞与K细胞是同一类细胞,或同一类细胞的不同分化阶段,但是,二者在带瘤动物和肿瘤病人体内上表现的功能不同,即NK细胞功能往往低下,而K细胞功能往往正常或增高。什么原因造成这一功能上的不同,本文对这个问题进行了初步研究。

四种NK细胞体外扩增方案的比较

目的:通过对4种NK细胞体外培养方案扩增后产物的细胞免疫表型、扩增倍数以及杀伤活性进行比较,确定一种高效的NK细胞体外扩增方案。方法:建立4种NK细胞体外培养方案:方案1为经典的NK细胞体外扩增方案(IL-2+IL-15);方案2为IL-2+IL-15+IL-18;方案3为IL-2+IL-15+IL-7;方案4为新型NK培养基(IL-2+OKT3)。收集天津医科大学附属肿瘤医院生物治疗科2012年2月至2012年4月间10例晚期实体瘤患者的PBMC,按照4种方案进行体外扩增。在体外扩增的0、5、10、15 d,采用流式细胞仪检测各淋巴细胞亚群(尤其是NK细胞)的比例;比较各方案体外扩增15 d后的NK细胞的扩增倍数、淋巴细胞亚群比例变化,并采用LDH法检测各方案扩增产物对人白血病K562细胞的杀伤活性。结果:上述4种NK细胞培养方案体外扩增15 d后,细胞总数分别扩增(40.1±20.00)、(44.08±22.09)、(44.82±23.67)、(46.82±25.02)倍,其中NK细胞的扩增倍数分别为(75.86±28.57)、(93.32±32.16)、(88.66±24.94),(58.88±41.53)倍。NK细胞比例由0 d的(20.44±2.23)%分别扩增至15 d的(48.30±13.90)%、(54.72±12.25)%、(55.94±12.70)%和(54.5±14.93)%;各培养方案组在总细胞扩增倍数、NK细胞扩增倍数上的差异均无统计学意义(P>0.05)。前3种培养方案体外扩增产物的杀伤活性明显高于方案4[(63.40±5.00)%、(77.30±9.40)%、(62.17±5.60)%vs(37.39±10.42)%,均P<0.05],而方案1、2、3之间体外扩增产物杀伤活性的差异则无统计学意义(P>0.05)。结论:细胞因子组合对于体外大规模培养NK细胞有着一定的优势,但不同的细胞因子组合(方案1中是否加入IL-18或IL-7)对NK细胞体外大规模扩增的影响差异并不显著;但前3个方案扩增产物对K562细胞的杀伤活性明显强于方案4。

表达HLA-G1的K562细胞抵抗外周血NK细胞杀伤作用的研究

目的研究 HL A- G1分子对 NK细胞杀伤活性的影响。方法借助脂质体介导的 DNA转染技术 ,将本室构建的真核表达质粒 pc DNA3 - HL A- G1转染人 K5 62细胞 ;通过 G4 18筛选 ,获得克隆化细胞株 K5 62 - G1;应用 RT- PCR及流式细胞术分别在 RNA水平和蛋白质水平检测 HL A- G1的表达 ;最后 ,应用 MTT比色法检测转染细胞对不同个体外周血 NK细胞杀伤活性的抑制效应。结果与转染了空质粒的对照组相比 ,外周血 NK细胞对 K5 62 - G1的杀伤率降低 3 2 .4 3 % ( P <0 .0 1)。结论靶细胞表达 HL A - G1分子可明显抑制 NK细胞的杀伤效应。

不同细胞因子诱导脐血来源的CIK、NK细胞对K562细胞杀伤活性的研究

目的:了解不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性的差异性。方法:通过SCF、FLT3L、IL2、IL7及IL15等细胞因子的不同组合扩增的脐血CIK、NK细胞,分为3组,A组(SCF+IL2+IL7+IL15)、B组(SCF+FLT3L+IL2+IL7+IL15)和C组(IL2+IL7+IL15,对照组);通过MTT法检测各组CIK、NK细胞在不同效靶比下对K562的杀伤率,计算各组的总杀伤单位。结果:经过21天培养A组体系中CIK+NK细胞的比例平均超过60%,B组CIK+NK细胞的比例平均超过70%,而C组约为50%;各组扩增的CBCIKNK细胞同组间在效靶比20∶1时对K562的杀伤率均显著高于10∶1(P<0.01)。在不同效靶比下A组CIKNK细胞对K562的杀伤率显著高于B和C组(P<0.01);C组CIKNK细胞对K562的杀伤率稍高于B组,但两组间对K562的杀伤率无显著性差异。A组总杀伤单位显著高于C组,与B组无显著差异。结论:不同细胞因子组合扩增的脐血CIK、NK细胞对人K562细胞株的杀伤活性有差异,考虑到对效应细胞的扩增效果,B组为具有最佳杀伤活性的脐血CIK、NK细胞培养体系,其中的SCF、FLT3L对CIKNK细胞诱导有协同效果。

IL-2和IL-15刺激脐血NK细胞对K562/Jurkat细胞的杀伤活性研究

本研究旨在探讨脐血(cord blood,CB)NK细胞的杀伤功能及细胞因子IL-2和IL-15对NK细胞杀伤K562/Jurkat细胞活性的影响。采用autoMACS及CD3阴选后CD56阳选两步免疫磁珠分选法从脐血单个核细胞纯化NK细胞,分选后NK细胞用流式细胞仪测定纯度,通过IL-2及IL-2和IL-15两种细胞因子组合培养3天,用LDH释放法检测培养前后脐血NK细胞对白血病细胞株K562和Jurkat的细胞毒活性(效靶比10∶1),并记录不同细胞因子培养体系条件下NK细胞的生长状况。结果表明,CB-MNC中CD3-CD56+细胞含量为(14.88±9.2)%,分选后CD3-CD56+细胞含量为(92.39±0.8)%;培养3天后,IL-2组NK细胞形成集落数为148.60±13.0,IL-2复合IL-15组NK细胞形成集落数为831.80±23.0,两者比较,有显著性差异;以K562为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK的杀伤活性为(27.76±8.8)%,IL-2组杀伤活性为(61.9±9.1)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(87.62±3.7)%,差别有统计学意义;以Jurkat为靶细胞时,新鲜纯化CB-NK细胞的杀伤活性为(29.32±2.5)%,IL-2组杀伤活性为(69.43±4.4)%,IL-2复合IL-15组杀伤活性为(92.95±3.2)%,差别有统计学意义。结论:脐血新鲜纯化NK细胞对K562、Jurkat细胞有一定的杀伤作用,但自发细胞毒活性较低,IL-2/IL-15刺激后杀伤活性显著提高,IL-15复合IL-2对促进脐血NK细胞的生长和提高其细胞毒活性明显优于单用IL-2。

反应性氧代谢物清除剂逆转ROM对NK细胞抗K562细胞系体外抑制作用

为了探讨新型反应性氧代谢物(reactiveoxygenmetabolites,ROM)清除剂在NK细胞抑制K562细胞时作为免疫佐剂的作用,采用IL-2及PHA活化单核(MO)细胞,使MO细胞的ROM产量增加,观察NK细胞活性和K562细胞抑制率(KIR)的相应变化,然后在不同比例的MO+NK+K562细胞培养体系中加入不同浓度的ROM清除剂(硫普罗宁),定期检测ROM产量及KIR(每种检测均做3个复孔),同时应用不同浓度的二氢氯组胺(DHT)作为阳性对照。结果表明:在K562细胞、NK细胞混合培养体系中,当E/T=10/1时,加入IL-2/PHA后ROM的产量从33.17±25.02U/ml增至223.59±59.41U/ml(P<0.05),KIR从65.56%升至85.89%(P<0.05);当按E/MO=10/2、10/5、10/10三种比例加入MO细胞后,ROM产量随着MO细胞数量的增加而增加(ROM产量分别为389.79±43.83U/ml,456.74±42.77U/ml,601.42±21.92U/ml),而KIR则相反(KIR分别为82.36%,81.36%,48.09%);而在K562+NK+MO+IL-2/PHA混合培养体系中加入硫普罗宁、DHT后,当E/MO=10/2时,ROM产量从389.79±43.83U/ml分别降至-1.20±60.70U/ml和50.21±22.4U/ml(P<0.05),KIR则从82.53%分别升至96.09%和94.64%(P<0.05)。随着硫普罗宁、DHT浓度的增加,ROM产量逐渐减少。ROM产量与KIR呈负相关(r=-0.518)。当E/MO为10/5或10/10时,各浓度硫普罗宁及高浓度的DHT可使ROM产量减少(P<0.05),但KIR提高不明显(P>0.05)。硫普罗宁在提高KIR的效应方面与DHT相似(P>0.05),而在清除ROM方面,硫普罗宁较DHT为优(P<0.05)。结论:①MO细胞是ROM产生的最主要来源,其产生的ROM可使NK细胞的抗瘤(抗K562)活性下降;②新型ROM清除剂(硫普罗宁)可有效清除ROM,在一定程度上逆转ROM对NK细胞抗K562细胞的抑制作用,且在逆转ROM方面优于DHT,在提高NK细胞对K562细胞的抑制率方面效应强度与DHT相似,但毒副作用较低,有望替代DHT作为免疫佐剂用于白血病的过继性免疫治疗中。

当归多糖对CIK细胞生物学特性及其杀伤活性的影响

目的:探讨当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide,ASP)体外对人外周血来源的细胞因子诱导的杀伤(cytokine induced killer,CIK)细胞的增殖、免疫表型及其对白血病K562细胞杀伤活性的影响。方法:分离健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),第0天加入IFN-γ(1 000 IU/ml),24 h后再加入IL-2(1 000 IU/ml)、抗CD3单抗(50 ng/ml)继续培养,此后每隔3 d根据添加不同浓度的ASP分为5组:A组(不加ASP)、B^E组(分别加ASP 12.5、25、50、100μg/ml)。全自动血细胞计数仪计数各组CIK细胞的增值情况,流式细胞术检测各组CIK细胞中CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+细胞的百分比,酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组CIK细胞上清液中IFN-γ及TNF-α的分泌水平,CCK-8法检测各组CIK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果:联合ASP诱导培养CIK细胞至第16天时,与A组相比,E组CIK细胞的增殖能力明显增加[(56.98±3.00)×106vs(43.81±2.14)×106,P<0.05)],各组细胞活率都保持在90%以上;各组CIK细胞CD3+CD4+、CD3+CD8+细胞比例无明显差异,而D组、E组CD3+CD56+细胞比例与A组相比存在差异[(26.65±3.71)%、(28.36±4.28)%vs(20.75±3.56)%,P<0.05)];E组CIK细胞在效靶比为40∶1、20∶1、10∶1时对K562细胞的杀伤活性比A组更强[(84.19±5.88)%vs(68.05±5.95)%、(76.69±6.54)%vs(64.55±9.44)%、(72.32±9.22)%vs(61.45±8.22)%,均P<0.05〗。结论:随着培养时间的延长,高浓度的ASP体外对CIK细胞的增殖及杀伤活性有一定的促进作用。

CD3+CD28抗体组诱导CD3AK细胞对肿瘤细胞杀伤效果的实验观察

CD3AK细胞是用于恶性肿瘤过继性免疫治疗的效应细胞之一,一般情况下即使小剂量的CD3抗体在白细胞介素-2（IL-2）的协同下也可诱导出具有杀伤活性的CD3AK细胞[1]。T细胞介导的细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要机制,随着对抗原的识别和递呈、T细胞激活等免疫应答机制认识的不断深入,发现有效的抗肿瘤免疫反应必须在共刺激信号的参与下,将肿瘤抗原多肽递呈给T细胞而激发T细胞的免疫应答[2]。

脐血来源树突状细胞增强CIK细胞对肺癌细胞株的杀伤作用

目的探讨肺癌细胞株A549肿瘤冻融抗原负荷脐血来源树突状细胞(DCs)与CIK细胞混合培养后对A549细胞杀伤活性的影响作用。方法取对数生长期的A549细胞制备肿瘤抗原(Ag),用脐血单个核细胞(CBMC)分别制备DCs和CIK细胞;用负荷Ag的DCs和CIK细胞共培养,诱导Ag-DC-CIK细胞。用流式细胞术检测DC免疫表型,MTT法检测CBMC、CIK、Ag-CIK和Ag-DC-CIK对A549肿瘤细胞株的杀伤活性。结果脐血DCs高表达CD86、CD40,中度表达CD83和CD80,低表达CD11c。实验组细胞(Ag-DC-CIK)对A549细胞的杀伤能力(62%)明显高于对照组(P<0.01),结论肿瘤抗原负荷的DCs能增强CIK细胞对靶细胞的杀伤活性,为DCs的免疫治疗提供了新的思路。

人参皂苷Rg_3对NK细胞与K562细胞的结合率及毒性作用影响的实验研究

目的:观察人参皂甙Rg3对NK细胞与K562细胞的结合率及毒性作用的影响,并探讨其直接抑制及诱导凋亡、抑制肿瘤新生血管形成等以外的机制。方法:采用流式细胞术检测不同浓度Rg3作用后NK细胞结合K562细胞的百分率以及NK细胞对K562细胞的直接毒性。结果:在Rg3浓度为0～50μg/mL范围内,NK细胞与K562细胞的结合率与浓度呈正相关。结论:Rg3能通过激活NK细胞,提高NK细胞与K562细胞的结合率,增强NK细胞的杀伤活性,从而起到抗肿瘤作用。

脐血CIK细胞诱导K562细胞的凋亡作用

探讨脐血CIK细胞对K5 6 2细胞的杀伤活性及诱导凋亡作用。通过第 1天在脐血淋巴细胞中加入IFN r,第 2天再加入IL 2和CD3单抗进行细胞培养获得多种细胞因子诱导的杀伤细胞 (Cytokinesinducedkillercells)即脐血CIK细胞。用MTT法测定其抗肿瘤活性 ,原位末端标记法进行凋亡分析 ,台盼蓝拒染法计数细胞。脐血CIK细胞及培养上清抗K5 6 2活性明显优于CD3AK细胞 ,短期培养后其增殖活性低于CD3AK细胞 ;但是加入G CSF可以提高CIK细胞的增殖活性 ,且CIK细胞的抗K5 6 2活性仍高于CD3AK细胞。CIK细胞诱导K5 6 2细胞凋亡率大于CD3AK细胞 ,G CSF能部分抑制CIK细胞诱导的K5 6 2细胞的凋亡。脐血CIK细胞是一种有效的杀伤活化细胞 。

稳定表达反义ATM/PI3K细胞系U937-ASPI3K的建立

为进一步研究DNA损伤杀灭肿瘤细胞的机制 ,为增强肿瘤治疗疗效提供一种有价值的细胞模型 ,构建了高效表达ATM基因编码羧基端 10 0kD功能片段的反义cDNA ,通过转染和筛选建立稳定表达反义ATM PI3KcDNA的细胞系U937 ASPI3K。结果显示 ,构建的ATM PI3KcDNA经测序证明反向定位于表达载体 pZeoSV2 (+ )中。经转染和筛选得到稳定表达 pZeoSV(+ ) ATM PI3K的细胞系U937 ASPI3K和对照细胞系U937 pZeoSV (- ) ,前者ATM蛋白表达极度受抑制 ,后者以及淋巴瘤细胞系U937ATM蛋白的高表达未受影响。本实验为阐明细胞周期关卡 (checkpoint)在DNA损伤信号传导通路中的作用机制 。

链式CIK细胞对白血病K562细胞的体外杀伤活性

目的:研究细胞因子诱导的体外细胞经过链式激活后获得的链式CIK细胞对白血病K562细胞的杀伤效应。方法:采用血细胞单采机从外周血分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),经过细胞因子诱导、扩增、培养得到链式CIK细胞,以CIK细胞作对照,检测链式CIK细胞的增殖能力,LDH释放法测定其对K562细胞的杀伤活性。结果:链式CIK细胞组在培养第5、第14天的细胞数低于CIK细胞组(P<0.01);链式CIK细胞对K562细胞的杀伤活性在效靶比40∶1和20∶1时分别为(56.1±2.24)%、(34.4±3.56)%,均低于CIK细胞(均P<0.01)。结论:链式CIK细胞是一种培养周期短、对白血病K562杀伤活性较弱的免疫细胞。

脐血CD_3AK细胞诱导K_(562)细胞凋亡的实验研究

目的 探讨脐血CD3AK细胞诱导K5 6 2 细胞凋亡的作用。方法 用细胞形态学观察 ,DNA琼脂糖凝胶电泳 ,原位末端标记法检测 2 0例K5 6 2 细胞、2 3例CD3AK细胞诱导的K5 6 2细胞凋亡率。结果 K5 6 2 细胞自然凋亡率 (3.5 0± 0 .97) % ;经CD3AK细胞诱导的K5 6 2 细胞凋亡率 (2 7.38± 4.91) % ,二者之间具有显著性差异 (t=15 .1 P <0 .0 1)。结论 脐血CD3AK细胞能诱导K5 6 2 细胞凋亡。

CIK细胞体外逆转多药耐药性的研究

目的:研究CIK细胞体外逆转多药耐药(multidrug resistance,MDR)可行性。方法:用人外周血分离出的单个核细胞,在不同细胞因子诱导下培养成细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK)及树突状细胞(DC),然后将其与成熟DC进行共培养,作为效应细胞,以K562敏感株与耐药细胞株为靶细胞进行体外逆转研究。流式细胞术检测靶细胞的P-gp表达及细胞内的ADR相对含量,MTT法测定其细胞毒作用,RT-PCR检测mdr-1基因耐药性逆转表达状况。结果:K562/ADR耐药细胞株ADR含量经效应细胞细胞作用后,细胞内的ADR含量分别提高了13.80%、39.50%,(P<0.01);,P-gp分别降低12.00%、42.69%,(P<0.01),mdr-1基因表达呈下调趋势,效应细胞对靶细胞的细胞毒作用分别达45.8%、78.9%,(P<0.01)。结论:CIK+K562/ADR-DC对P-gp高表达K562/ADR耐药细胞株具有特异性的细胞毒作用,有效提高了细胞内的ADR含量,下调了P-gp、mdr-1表达,使免疫效应细胞体外逆转多药耐药的效果得以显现。

螺旋藻多糖对CD_3AK细胞增殖能力的影响

研究了螺旋藻多糖（PS）对CD3McAb激活的杀伤细胞（CD3McAbactivatedkillercells,CD3AKcells）增殖能力的影响。结果表明，当PS浓度为2．5μg／ml培养体系条件下，对CD3AK细胞具有明显的刺激细胞增殖作用（P＜0．02）；对培养长达23d的CD3AK细胞杀伤肿瘤细胞（K563细胞）的活性仍维持在较高的水平（46．5％～50％）。

螺旋藻多糖对小鼠巨噬细胞及K细胞ADCC活性的影响

Ｃ（５７）ＢＬ／６Ｊ小鼠腹腔注射ＰＳＰ１００ｍｇ·ｋｇ（－１），连续１２ｄ，可明显促进小鼠Ｋ细胞ＡＤＣＣ活性，ＰＳＰ组Ｋ细胞毒指数（ＣＩ）比对照组升高５４．７％。在５ｍｇ／Ｌ～３２０ｍｇ／Ｌ浓度范围内，ＰＳＰ可促进体外培养的Ｃ（５７）ＢＬ／６Ｊ小鼠腹腔巨噬细胞ＡＤＣＣ活性，最适浓度为８０ｍｇ／Ｌ其ＣＩ值为对照孔的５．１４倍。

同种异体NK细胞KIR2DL1表达差异对其杀伤KG1A细胞活性的影响

目的:研究同种异体自然杀伤(natural killer,NK)细胞对人急性髓系白血病细胞株KG1A的杀伤率,探讨供者NK细胞表面杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL1(killer immunoglobulin-like receptor 2DL1,KIR2DL1)表达差异对NK细胞杀伤KG1A细胞活性的影响。方法:自9名健康志愿供者分离外周血NK细胞,流式细胞术检测NK细胞表面KIR2DL1的表达率,LDH释放法测定NK细胞在效靶比为20∶1时对KG1A细胞的杀伤活性。结果:NK细胞表面KIR2DL1的表达率存在个体差异,9名供者的表达范围为(33.20±1.95)%～(92.69±1.47)%;9名健康供者NK细胞对KG1A细胞的杀伤活性不同,杀伤率范围为(44.40±1.97)%～(93.70±1.12)%。不同个体NK细胞KIR2DL1表达率与其对KG1A细胞的杀伤率呈负相关(r=-1.00,P=0.00)。结论:不同个体NK细胞其表面KIR2DL1表达率与NK细胞对KG1A细胞的杀伤率呈负相关。

CD3AK细胞对白血病细胞杀伤活性的实验研究

目的应用CD3单克隆抗体(CD3McAb)和重组人白细胞介素-2(rhIL-2)共同诱导外周血单个核细胞制备CD3AK细胞,研究其对白血病细胞的杀伤作用。方法用台盼蓝活细胞计数法计算细胞扩增倍数,MTT法检测CD3AK细胞杀伤活性。结果正常人CD3AK细胞对各型急性白血病细胞及K562细胞均有明显的杀伤活性,且无显著性差异(P>0.05);急性白血病完全缓解期CD3AK细胞与正常人CD3AK细胞对白血病细胞的杀伤活性,亦无显著性差异(P>0.05);急性白血病未缓解期CD3AK对白血病细胞杀伤活性明显减弱,与正常人CD3AK细胞比较,差异非常显著(P<0.01)。结论正常人与急性白血病完全缓解期CD3AK细胞具有明显的抗白血病作用,急性白血病未缓解期CD3AK细胞杀伤活性明显减弱。

脐血CD_3AK细胞和其培养上清诱导K_(562)细胞凋亡

目的 探讨脐血CD3 AK细胞和其培养上清 (CS)诱导K562 细胞凋亡。方法 用细胞形态学观察 ,DNA琼脂糖电泳 ,原位末端标记法检测K562 ,CD3 AK细胞诱导的K562 ,CS诱导的K562 细胞凋亡率。结果 K562 细胞自然凋亡率 3.5 0± 0 .97% ;CD3 AK细胞诱导的K562 细胞凋亡率 2 7.38± 4.91% ,P <0 .0 1,CS诱导的K562 细胞凋亡率为 33.0 9± 5 .2 2 % ,P <0 .0 1。结论 脐血CD3 AK细胞和其培养上清能诱导K562 凋亡。