猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立

猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。

稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的CHO-K1细胞系的建立及免疫原性分析

建立高表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,鉴定蛋白的免疫原性,为开发新型且有效防治猪圆环病毒的亚单位疫苗奠定基础。构建重组质粒pEE12.4-PCV2-Cap,转染CHO-K1细胞,通过加压筛选,有限稀释,细胞悬浮驯化及Western blot检测得到高表达Cap蛋白的悬浮稳转单克隆细胞株,并对该细胞株进行发酵,纯化得到的目的蛋白,通过小鼠免疫验证其免疫原性。结果表明PCV2-Cap蛋白能够在CHO-K1细胞中正确表达;发酵过程中活细胞密度高达6×10~6个·mL^(-1),细胞活力在80%以上,PCV2-Cap蛋白表达量约为370 mg·L^(-1);利用间接ELISA检测小鼠免疫后血清中的抗体水平,证明了利用CHO-K1细胞生产的Cap蛋白具备良好的免疫原性。本研究成功构建了表达PCV2-Cap蛋白的CHO-K1悬浮稳转细胞系,并进一步对目的蛋白进行免疫原性分析,为猪圆环病毒亚单位疫苗的开发打下扎实的基础。

CHO-K1细胞培养上清及其外泌体的蛋白质组分析

目的:确定CHO-K1细胞能否够分泌外泌体,运用液相色谱-质谱联用技术鉴定无血清培养条件下CHO-K1细胞培养上清中的蛋白质和外泌体中蛋白质的成分。方法:将CHO-K1细胞驯化至无血清培养基中,采用exoRNeasy血清/血浆试剂盒提取培养基中的外泌体,透射电镜复染法鉴定其大小和形态,质谱法鉴定标志蛋白;提取培养上清和外泌体中的蛋白,运用nanoLC-ESI-MS-MS技术进行鉴定,对鉴定到的蛋白质进行基因本体论(GO)注释分析。结果:从培养上清样本中鉴定到1243种蛋白质,分子质量范围在7~559 kDa,等电点(PI)在3~11;透射电镜下可见外泌体的双层膜小囊泡结构;从外泌体样本中鉴定到1259种蛋白质,分子质量范围在5~4007 kDa,等电点在3~12,其中鉴定到外泌体标志蛋白有膜连蛋白、肿瘤易感蛋白、Rab蛋白、热休克蛋白-90和热休克蛋白-60;GO注释结果显示上清蛋白和外泌体蛋白主要都来源于细胞器和细胞的膜结构。结论:形态学和标志蛋白的鉴定结果确认CHO-K1细胞的培养上清中存在外泌体,并初步构建了无血清条件下CHO-K1细胞的培养上清蛋白质和外泌体蛋白质的质谱数据集。

稳定表达犬细小病毒VP2结构蛋白的CHO-K1细胞系的建立

为构建犬细小病毒VP2基因分泌性表达细胞系,通过酶切将人CD5信号肽序列从质粒中切出,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1A的多克隆位点上,构建成pcDNA3.1-CD5sp质粒。然后再通过PCR方法扩增犬细小病毒VP2基因,并将其插入到pcDNA3.1-CD5sp载体中CD5信号肽的下游,使其与CD5信号肽序列融合,构建成VP2基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5sp-VP2。经脂质体介导转染细胞,后通过G418筛选,建立出稳定表达VP2蛋白的CHO-K1细胞系。测序结果表明,构建的犬细小病毒VP2基因的分泌型表达载体结构正确,表达载体经脂质体介导转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出稳定转染VP2基因的细胞株,经PCR检测证明VP2基因已经整合到细胞的染色体中;经RT-PCR、Westernblot分别检测VP2基因表达的mRNA和VP2蛋白,证明犬细小病毒VP2基因能够在CHO-K1细胞进行稳定性表达。这为下一步研究犬细小病毒VP2蛋白与宿主细胞的相互作用及VP2DNA疫苗奠定了基础。

利用CRISPR/Cas9技术敲除CHO-K1细胞中GS基因的研究

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)是合成CHO细胞生长所需要的谷氨酰胺的关键酶。为了获得能快速稳定表达外源蛋白的CHO细胞GS筛选系统,根据CRISPR/Cas9技术原理,针对GS基因设计3对sg RNA,分别将连接sg RNA的pX459质粒转染至CHO-K1细胞中以便定向敲除GS基因;经筛选后利用PCR及测序分析鉴定GS基因敲除情况;将GS基因敲除的CHO细胞株(CHO^(GS-/-))分别在含有外源谷氨酰胺培养基与无谷氨酰胺培养基中进行培养,观察细胞的生长状态,绘制生长曲线,并验证该CHO^(GS-/-)细胞株中外源基因的表达能力。结果显示,sg RNA3与sg RNA4共转染能高效双靶位敲除CHO细胞中的GS基因;生长曲线显示CHO^(GS-/-)细胞在富含谷氨酰胺的培养基中生长速度正常或无差异,但无法在无谷氨酰胺的培养基中存活,这表明GS基因功能被破坏;外源基因表达水平及功能验证显示,敲除GS基因后不影响外源单抗在细胞中的表达。这表明,借助CRISPR/Cas9敲除系统获得了CHO^(GS-/-)细胞,大大提高了稳定转染外源基因阳性细胞株的筛选效率,为后期利用CHO细胞大量发酵表达蛋白技术建立了坚实的分子生物学平台。

HINT2在甲状腺乳头状癌中的表达和功能研究

HINT2与多种肿瘤发生发展密切相关,在甲状腺癌中的功能还不清楚。该文使用组织芯片检测甲状腺乳头状癌组织中HINT2的表达,发现12例癌组织中HINT2蛋白表达水平显著高于正常组织(86%,P<0.05)。该文构建高表达和低表达HINT2的甲状腺乳头状癌细胞系K1稳定克隆后,使用CCK8和克隆形成实验检测HINT2对细胞增殖能力的影响,采用Transwell和划痕法检测细胞迁移能力,使用Matrigel Transwell法检测细胞侵袭能力。结果发现,高表达HINT2促进了K1细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而干扰HINT2则抑制了细胞的这些恶性表型。最后,该文用Western blot方法检测AKT和ERK的活化情况,发现高表达HINT2促进AKT和ERK的磷酸化,而干扰HINT2则抑制AKT和ERK的磷酸化。这些结果说明,HINT2可能是甲状腺乳头状癌的原癌基因,通过调控PI3K/AKT和MAPK/ERK通路影响甲状腺肉头状癌的恶性表型。